Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em> Xenopus</em> Kidney

O rim embrionário de Xenopus, as pronephros, é um bom modelo para o estudo do desenvolvimento e doença renal. Os embriões desenvolvem externamente, são grandes em tamanho, podem ser produzidos em grandes números, e são facilmente manipulados através de microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, os genes que regulam o desenvolvimento do rim em mamíferos e anfíbios são conservados. Rins de mamíferos progredir através de três etapas: a pronephros, mesonephros e metanephros ^1, enquanto anfíbios embrionárias têm um pronephros e anfíbios adultos têm um metanephros. A unidade de filtragem básica dessas formas de rim é o néfron, e ambos os mamíferos e anfíbios exigir os mesmos cascatas de sinalização e eventos indutivos se submeter nefrogênese ^{2, 3.} Os pronephros Xenopus contém um único néfron composto por proximal, intermediário, distal e conectando túbulos, e um Glomus (análogo ao do glomérulo de mamífero) ^{1, 4-6} (Figura 1 </strong>). A única, grande nefrónio presente nas pronephros Xenopus torna-o adequado como um modelo simples para o estudo de genes envolvidos em processos de desenvolvimento renal e doença.

Mapas celular fate foram estabelecidas para embriões de Xenopus, e estão disponíveis gratuitamente on-line em Xenbase ^7-11. Aqui, nós descrevemos uma técnica para microinjecção de marcadores de linhagem para direccionar o desenvolvimento de Xenopus pronephros, embora a mesma técnica pode ser adaptado para outros tecidos alvo tais como o coração ou olhos. marcadores de linhagem são etiquetas (incluindo corantes vitais, dextranos marcados com fluorescência, enzimas detectáveis ​​histoquimicamente, e ARNm que codificam as proteínas fluorescentes) que pode ser injectado num blastómero cedo, permitindo a visualização da descendência da célula que durante o desenvolvimento. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, membrana alvo que codifica a proteína fluorescente vermelha ^12, como um marcador de linhagem. A tecnologia de microinjeção alvonicas para blastómeros individuais em embriões de células 4- 8 e descritas aqui podem ser utilizadas para injecção com morpholinos para derrubar a expressão do gene, ou com RNA exógeno para sobre-expressar um gene de interesse. Ao injectar no blast�ero ventral, vegetal, principalmente as do embrião pronephros vai ser alvo, deixando os pronephros contralaterais como um controlo do desenvolvimento. Co-injeção de um traçador verifica se o blastomere correta foi injetado, e mostra que os tecidos no embrião surgiu a partir da blastomere injetado, verificando a segmentação dos pronephros. Imunocoloração das pronephros permite a visualização de quão bem os túbulos pronephric foram alvejados. A sobre-expressão e efeitos de knockdown pode então ser marcado contra o lado contralateral do embrião, o qual serve como um controlo de desenvolvimento, e podem ser usados ​​para calcular o índice pronephric ^13. A disponibilidade de mapas destino celular permite que esta técnica de microinjecção objectivo de ser utilizada para os tecidos alvo othER do que os pronephros, e a co-injecção de um traçador fluorescente permite a micro-injecção direccionada para cada tecido a ser verificada antes da análise.

Durante a microinjeção de embriões, a temperatura de desenvolvimento deve ser regulamentado firmemente, dado que a taxa de desenvolvimento de Xenopus é altamente dependente dele ^14. Os embriões devem ser incubados a temperaturas mais baixas (14 – 16 ° C) para as injecções de células-4- 8 e porque o tempo de desenvolvimento é abrandado. A 22 ° C, o tempo de desenvolvimento de uma fase (1 célula) a fase 3 (4 células) é de aproximadamente 2 horas, enquanto que o tempo de desenvolvimento de 16 ° C para a fase 3 é de aproximadamente 4 horas. Demora cerca de 15 minutos para ir de um embrião de 4 células para uma célula-8 (etapa 4) de embriões a 22 ° C, mas demora cerca de 30 minutos a 16 ° C. Do mesmo modo, a 22 ° C, leva apenas 30 minutos para um embrião de 8 células de progredir para uma célula embrionária 16 (etapa 5). Este tempo é aumentado para 45 minutos a 16 ° C. oguinte, que é útil para diminuir a taxa de desenvolvimento dos embriões para permitir tempo suficiente para injecções na fase de 8 células antes de os embriões progredir para a fase de 16 células. Além disso, as temperaturas de crescimento pode ser modulada para acelerar ou retardar o desenvolvimento embrionário até o rim foi totalmente desenvolvido.

A epiderme de girino em estágio embriões de Xenopus é relativamente transparente, permitindo a fácil imagem dos pronephros em desenvolvimento sem dissecção ou compensação do tecido ^15. Devido à relativa transparência de embriões de Xenopus, imagens de células vivas também é viável ^16,17. Todo-mount imunocoloração para visualizar as pronephros é possível com anticorpos estabelecidos que rotulam o proximal, intermediário, distal e túbulos de ligação de fase 38 – 40 embriões que permitem a avaliação do desenvolvimento pronephric depois alvo de manipulação da expressão do gene em embriões de Xenopus ^18-20.