Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em> Xenopus</em> riñón

El riñón embrionario de Xenopus, el pronefros, es un buen modelo para estudiar el desarrollo del riñón y la enfermedad. Los embriones se desarrollan externamente, son de tamaño grande, se pueden producir en grandes cantidades, y son fácilmente manipulados mediante microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se conservan los genes que regulan el desarrollo del riñón en mamíferos y anfibios. Riñón de los mamíferos desarrollará en tres etapas: el pronefros, mesonefros y metanefros ^1, mientras que los anfibios embrionarias tienen un pronefros y anfibios adultos tienen un metanefros. La unidad de filtrado básico de estas formas de riñón es la nefrona, y ambos mamíferos y anfibios requieren las mismas cascadas de señalización y eventos de inducción para someterse a nefrogénesis ^{2, 3.} Los pronefros Xenopus contiene una sola nefrona compuesto por proximal, intermedia, distal y la conexión de los túbulos, y un glomus (análogo al glomérulo mamífero) ^{1, 4 a 6} (Figura 1 </strong>). El único, gran nefrona presente en el pronefros de Xenopus lo hace adecuado como un modelo simple para el estudio de genes implicados en los procesos de desarrollo del riñón y enfermedades.

Mapas del destino celular se han establecido los primeros embriones de Xenopus, y están libremente disponibles en línea en Xenbase ^7-11. A continuación, describimos una técnica de microinyección de marcadores de linaje para orientar el pronefros Xenopus en desarrollo, aunque la misma técnica se puede adaptar a dirigirse a otros tejidos como el corazón o los ojos. trazadores Lineage son etiquetas (incluidos colorantes vitales, dextranos marcados con fluorescencia, enzimas histoquímicamente detectables, y mRNA que codifican proteínas fluorescentes) que se pueden inyectar en un blastómero temprano, lo que permite la visualización de la progenie de esa célula durante el desarrollo. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, que codifica la membrana dirigida proteína fluorescente roja ^12, como trazador de linaje. La tecnología orientada microinyeccióntécnicas para blastómeros individuales en embriones de 8 celdas de 4 y descritos aquí pueden ser utilizados para la inyección con morfolinos para derribar la expresión de genes, o con ARN exógeno que sobreexpresan un gen de interés. Inyectando en el blastómeras ventral, vegetal, principalmente se dirigirán los pronefros del embrión, dejando el pronefros contralateral como control del desarrollo. Co-inyección de un trazador verifica que se inyectó el blastómero correcta, y muestra que los tejidos en el embrión surgió de la blastómero inyectado, la verificación de la orientación de los pronefros. La inmunotinción de las pronefros permite la visualización de lo bien que han sido blanco de los túbulos pronéfricos. Sobreexpresión y desmontables efectos pueden ser marcados contra el lado contralateral del embrión, que sirve como un control de desarrollo, y se pueden utilizar para calcular el índice pronephric ^13. La disponibilidad de mapas destino celular permite que esta técnica de microinyección concretas, que sirva a los tejidos diana OTHer que los pronefros y co-inyección de un trazador fluorescente permite la microinyección dirigida a cada tejido a ser verificada antes del análisis.

Durante la microinyección de embriones, la temperatura de desarrollo debe ser regulada fuertemente, dado que la tasa de desarrollo de Xenopus es altamente dependiente de ella ^14. Los embriones se incubaron a temperaturas más bajas (14 – 16 ° C) para las inyecciones de células 4- 8 y debido a que el tiempo de desarrollo se hace más lenta. A 22 ° C, el tiempo de desarrollo de la etapa 1 (1 célula) a la etapa 3 (4 celdas) es de aproximadamente 2 horas, mientras que a los 16 años el tiempo de desarrollo ° C a la etapa 3 es de aproximadamente 4 horas. Se tarda aproximadamente 15 minutos para el final de un embrión de 4 células a una de 8 celdas (etapa 4) de embriones a los 22 ° C, pero tarda aproximadamente 30 minutos a 16 ° C. Del mismo modo, a 22 ° C, sólo se tarda 30 minutos para que un embrión de 8 células para pasar a un embrión de 16 células (etapa 5). Este tiempo se aumentó a 45 minutos a 16 ° C. losrefore, es útil para disminuir la tasa de desarrollo de los embriones para permitir tiempo suficiente para que las inyecciones en la etapa de 8 células antes de que los embriones pasar a la fase de 16 células. Además, las temperaturas de crecimiento pueden modularse para acelerar o ralentizar el desarrollo embrionario hasta que el riñón ha desarrollado plenamente.

La epidermis de renacuajo etapa embriones de Xenopus es relativamente transparente, permitiendo una fácil obtención de imágenes de los pronefros en desarrollo sin disección o limpieza del tejido ^15. Debido a la relativa transparencia de los embriones de Xenopus, imágenes de células vivas es también factible ^16,17. Todo el montaje inmunotinción para visualizar el pronefros es posible con anticuerpos establecidos que etiquetan los extremos proximal, intermedio y distal túbulos de conexión de fase de 38 – 40 embriones que permiten la evaluación del desarrollo pronephric después de la manipulación específica de la expresión génica en embriones de Xenopus ^18-20.