Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.
İşlenmiş nanopartiküller tedavi ve teşhis amaçları için çok umut verici özellikleri ile donatılmış bulunmaktadır. Bu çalışma, bağışıklık hücreleri ile etkileşimi nanopartikül çalışma akış sitometresi ile analiz hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Primer bağışıklık hücreleri kolayca antikor aracılı bir manyetik izolasyon, insan veya fare dokularından saflaştırılabilir. İlk olarak, bir Akış Sitometresi çalışan farklı hücre popülasyonları iç karmaşıklığı hücre ile ilişkili hücre büyüklüğü ile orantılı olan ön-dağınık ışık (FSC) ve yan dağınık ışık (SSC), ile ayırt edilebilir. Ayrıca, spesifik hücre yüzey reseptörlerine karşı floresan işaretli antikorlar, aynı örnek içinde birkaç alt popülasyonlarının belirlenmesi izin verir. Hücreler fizyolojik ve morfolojik durumu değiştirmek dış uyaranlarla artırdığını zaman Genellikle, tüm bu özellikler değişir. Burada, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartiküller inci belirlemek için bir model olarak kullanılmaktadırİnsan kan bağışıklık hücrelerinde nano yapılı malzeme e içselleştirme. Hücre floresan ve yan dağınık ışık artışı nanopartiküller ile inkübasyondan sonra bize zaman ve nanopartikül-hücre etkileşiminin konsantrasyon bağımlılığı tanımlamak için izin verdi. Ayrıca, bu tür protokol birincil mikroglia, merkezi sinir sistemi yerleşik bağışıklık hücreleri, özellikle monosit / makrofaj Yeşil floresan proteini (GFP) ifade mutant farelerden izole edilmiş olan Rhodamine-SiO 2 nanoparçacık etkileşimi araştırmak için uzatılabilir. Hücrelere nanoparçacık içselleştirilmesi ile ilgili veriler konfokal mikroskopi ile teyit edilmiş sitometri Nihayet, akış.
İşlenmiş nanomaddeler günümüzde biyomedikal 1 potansiyel uygulamalar için yaşam bilim adamlarının ilgisini ilham edilir. Inorganik ve organik maddelerin çok çeşitli fiziksel farklı şekil ve kimyasal özellikleri ile oluşturulan nano üretmek için kullanılabilir. Bu yapılar arasında, küre şeklinde tasarlanmıştır nanopartiküller tanı ve translasyon tıp 2 için büyük bir potansiyel göstermiştir. Onların çekirdek ve yüzey tasarım olası bir uygulama tarafından tahrik edilir ve nanoparçacık temas ve etkileşimi aşağıdaki hedef hücre yanıtlarının derin bir çalışma anlamına gelir. Kasıtlı insan deneklere uygulanabilir düşünülen Nanoparticles bağışıklık hücrelerinin çeşitli ile doğrudan temas edecektir. Vücut bütünlüğünü korumak için kendi sorumluluk onları nanotıpta 3 soruşturmanın önemli bir konu yapar.
Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin hücresel bölümü esas olarak phago ile temsil edilircytes. Bunlar arasında, monosit / makrofaj soyu, merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere elde edilen yerleşik mikroglia hücreleri, bağışıklık savunma 4,5 önemli bir rol oynamaktadır. Bunlar yabancı cisimlerin ile karşılaştıktan sonra birkaç saat içinde koruyucu tepkileri tetiklemek için edebiliyoruz. Ayrıca, monositik hücreler koordine ve sitokin salınımı yoluyla edinilmiş bağışıklık yanıtı talimat. Tüm bu olaylar da büyük ölçüde bağışıklık sistemi tarafından 6 "kendinden olmayan" olarak algılanan işlenmiş malzemelerin mevcudiyetinde meydana gelir.
Tarihsel hücre analizi için immünoloji kullanılan yöntemler arasında, en güçlü araçlardan birini temsil akım sitometri. Bundan başka, (genellikle tutulmasına ya da tek bir zar proteini varlığını istismar) spesifik bir bağışıklık alt popülasyonun tanımlanmasında veya saflaştırma teknolojileri durumuna izin veren belirli bir birincil ce belirli bir nanoparçacık etkilerinin kesin bir incelemell tipi 7. Ancak, hücre nanopartiküller maruz kaldıktan sonra fizyolojik ve morfolojik değişiklikler ortaya çıkabilir. Yanı sıra, nanopartiküller elde edilen sonuçları 8 etkileyen, tanımlanan dalga boylarında bu tür ışığın emilmesi veya emisyon olarak özel optik parametreleri, engel olabilir. Bu nedenle, kullanım ve yeni malzemelerin çalışma klasik immünolojik deneylerde nihai uyarlamalar limitleri dikkate alınmalıdır.
Bu çalışma, akış sitometresi ile birincil bir bağışıklık hücreleri ile etkileşimleri nanopartikül saptanmasını ilgilidir. Bu sorunu gidermek için, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikülleri yöntemini açıklamak için bir model nanomateryal olarak istihdam edildi. Silika parçacıkları nano ölçekli metrik çok hassas bir şekilde üretilebilmektedir. Bu tür ücret veya hidrofobisiteyi gibi boyut, şekil ve yüzey özellikleri, ince onların biyouyumluluk 9 artırmak için ayarlanmış olabilir. 2 nanopartiküller onları bir olarak kullanılmasına izin SiO birçok özelliğiİlaç vermek için örnek 10, parçacıklar. Ayrıca, flüoresan boyalar ya da kuantum nokta tutulabilir veya görüntüleme amaçları için yararlı 11 nano-araçlar sunan bu parçacıklara bağlanabilir.
Deneysel protokol, dikkate alınması gereken çok önemli bir nokta sunuyor. Bu, daha yüksek sıcaklıklar ve ışıklar negatif boyama verimini etkileyebilir, çünkü, tüm boyama aşamaları boyunca (buz üzerinde), 4 ° C 'de ve muhtemelen karanlıkta çalışmak için çok önemlidir. Nanopartikülleri daha iyi sadece kullanımdan önce yeniden süspanse edilmesi için sonicated olabilir.
Sitometri analizi düzgün bir şekilde farklı kanallar doğru bir kalibrasyon gerektirir. Cihazın kalibrasyonu, her bir deneysel oturumda önce yapılmalıdır. Enstrümantasyon ile teknik sorunların yanı sıra, aynı zamanda antikor etiketleme ile ilgili sorunlar olabilir. Bu, uygun bir konsantrasyonda antikor kullanmak zorunludur. Konsantrasyonu çok yüksek veya çok düşükse, dissatisfying sinyal yoğunlukları sonucu olabilir.
Bu teknik, endişe dezavantajları tek dağılımlı örnekleri ile çalışan ihtiyaç, yetersizlik yerelleştirilmesinesinyali (örneğin farklı hücre bölmeleri) menşe site. Birlikte kullanılmak üzere fluorochromes seçiminde bazı kısıtlamalar vardır: eksitasyon ve emisyon dalga boyu bantların yeterince bunların uygun ölçüm izin vermek için ayrılmalıdır. Kullanılan antikor spektrumları çakışırsa, doğru kompanzasyon gereklidir.
Akış sitometrisi varlığında veya nanopartiküllerin yokluğunda hücre analizi için güçlü bir yöntemdir. Bu teknik, bir hücrenin bir çok değişkenli bir çalışma, incelenen etkinlikleri yüksek sayıda izin verir, analiz (1.000 'den fazla hücre / sn), tekrarlanabilirlik ve istatistiksel bir okuma hızı. Numuneler, hücre canlılığı kaybetmeden işlenebilir.
Floresan etiketli nanopartiküller kullanılarak bu hücre zarında bulunan özel markörler ile tanımlanır hücre alt, kendi içselleştirme hak ve ölçmek mümkündür. Hücre parametreleri s mevcudiyetinde değiştirebilir pecific nanopartiküller. Araştırmanın amacı ile ilgili olarak, bu tür varyasyonlar orantılı olarak artan nanopartikül içselleştirme oranı ile artar hücrelerin yan saçılması gibi belirli bir fenomen tanımlamak için kullanılabilir.
Hücre yüzeyinin Nanopartikül indüklenen modifikasyonları da bu tekniğin bir sınırlama temsil edebilir. Bu nedenle, hücre membran reseptörleri devir her zaman dikkate alınmalıdır ve muhtemelen tam olarak ilgi hücre popülasyonu karakterize etmek için önceden bilinir. Nanoparçacık aşırı örneklerinde membran osmoz aşırı bozuklukları hücre ölümüne yol açabilir.
Nano malzeme doza bağımlı deneysel toksisite, her bir hücre popülasyonu için test edilmelidir. Açıkça tanımlanmış ölü hücreler floresan ölçümü dışında tutulmalıdır. Örneğin, Annexin V / PI boyama, genellikle nekrotik ve apoptotik hücrelerin hem de tespit etmek için kullanılan çeşitli yöntemlerden biridir.
"> GFP ifade birincil hücreler aynı zamanda, belirli bir hücre subpopülasyonu seçmek ve prelabeling olmadan veri toplamak için güçlü bir araçtır. Tamamlayıcı floresan nanopartiküller ile kombinasyon hücre nanoparçacık etkileşimin çok hızlı ve hassas ölçümü. Uyuşturucu ya da gen teslimi düşünülüyor verir Seçilen dokulara spesifik bir ilaç yükünü serbest bırakmak mümkün nanopartiküllerin uygulanması ile gelecekte geliştirilebilir.Nanopartiküller Pharmaceutics için taşıyıcılar olarak teslim özel ve / veya bağışıklık modülatörleri, ve iş hücre nanoparçacık etkileşimleri incelemek için biyolojik ortamının bilgi (yani, akış sitometrisi yoluyla) gerektirir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia tarafından desteklenmiştir.
Yazarlar bu yazının sponsorluk için Mıltenyı Bıotec GmbH ile (Bergisch Gladbach, Almanya) kabul etmek istiyorum, Dr Paolo Petrucciani insan buffy kat sağlamak için (Immuno-Hematoloji ve Transfüzyon Servisi, Hastane Lotti Pontedera, Pisa, İtalya Bölümü) ve Prof Massimo Pasqualetti (Biyoloji Bölümü – Hücresel Birim ve Gelişimsel Biyoloji, Pisa, Pisa Üniversitesi, İtalya) konut için fare kolonisi.
HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |