Анализ наночастиц взаимодействии с определенными субпопуляций иммунных клеток методом проточной цитометрии.
Наночастиц наделены очень перспективных свойств для терапевтических и диагностических целей. Эта работа описывает быстрый и надежный метод анализа с помощью проточной цитометрии для изучения взаимодействия наночастиц с иммунными клетками. Первичные клетки иммунной системы может быть легко очищен от человеческих или мышиных тканей антитело-опосредованной магнитного изоляции. В первую очередь, различные клеточные популяции, работающие в цитометром потока можно отличить по рассеянного вперед света (ФСБ), которая пропорциональна размеру ячейки, и боковой рассеянный свет (SSC), связанных с клеточными внутреннюю сложность. Кроме того, флуоресцентно меченые антитела против специфических рецепторов клеточной поверхности позволяют идентифицировать нескольких субпопуляций в пределах того же образца. Часто все эти свойства различаются, когда клетки повышаются на внешние раздражители, которые изменяют их физиологических и морфологических состояние. Здесь, 50 нм FITC-SiO 2 наночастицы использованы в качестве модели для определения йэ интернализация наноструктурированных материалов в крови иммунных клеток человека. Флуоресценции клеток и боковые рассеянного увеличение свет после инкубации с наночастицами позволило нам определить время и концентрационные зависимости взаимодействия наночастиц клетки. Более того, такой протокол может быть продлен по расследованию Родамин-SiO 2 наночастиц взаимодействие с первичным микроглии, центральной нервной иммунных клеток системы резидентов, изолирован от мутантных мышей, которые специально экспрессии белка зеленый флуоресцентный (GFP) в моноциты / макрофагов. Наконец, проточной цитометрии данные, относящиеся к интернализации наночастиц в клетки были подтверждены с помощью конфокальной микроскопии.
Наноматериалов являются в настоящее время вдохновляет интерес ученых жизни для потенциальных применений в биомедицине 1. Широкое разнообразие органических и неорганических материалов, могут быть использованы для получения наноструктур с различными формами, физических и химических характеристик. Среди этих структур, искусственных наночастиц сферической формы продемонстрировали большой потенциал для диагностики и трансляционной медицины 2. Их основной и конструктора движет возможного применения и это подразумевает глубокое изучение ответов клеток-мишеней следующие наночастиц контакт и взаимодействие. Наночастицы, что, как полагают, быть намеренно введении человеку придет в непосредственном контакте с несколькими типами иммунных клеток. Их ответственность, чтобы сохранить целостность тела делает их важной темой исследования в области наномедицины 3.
Клеточная часть врожденной иммунной системы в основном представлена фагоциты. Среди них, моноциты / макрофаги линия клеток, полученных, в том числе центральной нервной микроглии система резидентов, играют ключевую роль в иммунной защите 4,5. Они способны вызвать защитные реакции в течение нескольких часов после встречи с зарубежными органами. Кроме того, моноцитов клетки координации и поручить адаптивный иммунный ответ посредством высвобождения цитокинов. Все эти события происходят даже в присутствии инженерных материалов, которые в значительной степени воспринимается как "несамосопряженной" иммунной системой 6.
Среди методов исторически используемых в иммунологии для анализа клеток, проточной цитометрии представляет собой один из самых мощных инструментов. Кроме того, наличие технологий для идентификации или очистки специфического иммунного субпопуляции (часто эксплуататорского исключение или наличие одного мембранного белка) позволяет точное исследование воздействия определенного наночастицы на этой конкретной первичной сеТип LL 7. Однако клетки могут представлять физиологические и морфологические изменения после воздействия наночастиц. Кроме того, наночастицы могут мешать конкретных оптических параметров, таких как поглощения или излучения света на заданных длинах волн, воздействуя полученные результаты 8. Так, ограничения по применению и возможных адаптаций классических иммунологических анализов к изучению новых материалов должны быть рассмотрены.
Эта работа касается обнаружения наночастиц взаимодействия с первичными иммунных клеток методом проточной цитометрии. Для решения этого вопроса, 50 нм FITC-SiO 2 наночастицы были использованы в качестве модели наноматериала, чтобы описать метод. Silica частицы могут быть получены в очень точно в нано-метрика масштабе. Размер, форма и поверхностные свойства, такие как заряд или гидрофобность, может быть точно настроена, чтобы увеличить их биосовместимость 9. Многие особенности SiO 2 наночастиц позволяет им быть использованы в качествемодель для доставки лекарств частиц 10. Кроме того, флуоресцентные красители или квантовые точки могут быть захвачен или связаны с этими частицами, предлагающих полезные нано-инструменты для работы с изображениями целей 11.
Работают представляет очень важных моментов, которые необходимо принять во внимание. Это действительно важно для работы при температуре 4 ° С (на льду) и, возможно, в темноте в течение всех этапов окрашивания, так как более высокие температуры и света может негативно сказаться на урожайности окрашивания. Наночастицы могут быть ультразвуком быть лучше ресуспендировали непосредственно перед использованием.
Правильное проточной цитометрии анализа требует правильной калибровки в различных каналах. Калибровка прибора должна быть выполнена перед каждой экспериментальной сессии. Кроме технических проблем с приборами, может быть также проблемы с маркировки антител. Он является обязательным использовать антитела в соответствующей концентрации. Если концентрация слишком высокая или слишком низкая, не удовлетворяющие интенсивности сигналов может быть следствием.
К недостаткам этой методики озабоченность необходимости работы с монодисперсных образцов, неспособность локализоватьсайт происхождении сигнала (т.е. различные клеточные отсеков). Есть также некоторые ограничения в выборе флуорохромами, которые будут использоваться в комбинации: длина волны возбуждения и полос излучения должны быть достаточно разделены, чтобы позволить их надлежащего измерение. Если используемые спектры антител перекрываются, правильно компенсация не требуется.
Проточная цитометрия представляет собой мощный метод анализа клеток в присутствии или в отсутствие наночастиц. Эта техника позволяет многопараметрическая изучение клетки, большое количество событий, рассмотренных, быстрота анализа (более 1000 ячеек / с), воспроизводимости и статистические показания. Образцы могут быть обработаны без потери жизнеспособности клеток.
С помощью флуоресцентно меченных наночастиц можно претендовать и количественной оценки их интернализации в клеточных субпопуляций, которые, определенных специфических маркеров, выставленных на клеточной мембране. Параметры решетки может изменяться в присутствии S pecific наночастицы. В зависимости от цели исследования, эти изменения могут быть использованы для идентификации конкретного явления, такие как боковой рассеяния клеток, которые пропорционально возрастает с увеличением скорости интернализации наночастиц.
Наночастиц-индуцированной модификации поверхности клеток также может представлять собой ограничение этого метода. По этой причине оборот рецепторов клеточных мембран должно быть всегда принимать во внимание и, возможно, известны заранее, чтобы точно охарактеризовать популяцию клеток интерес. Экстремальные нарушения мембранного осмоса в наночастиц перегружен образцов может привести к гибели клеток.
Наноматериалов зависит от дозы токсичность следует эмпирически проверены на каждой клеточной популяции. Четко определенные мертвые клетки должны быть исключены из флуоресценции количественного. Например, окрашивание аннексина V / PI является одним из нескольких методов, обычно используемых для обнаружения и некротические и апоптотических клеток.
"> GFP-экспрессирующих первичные клетки также являются мощным инструментом, чтобы выбрать определенный субпопуляции клеток и сбор данных без prelabeling. Сочетание с дополнительными люминесцентных наночастиц позволяет очень быстро и точно количественная оценка взаимодействия клеток наночастиц. Наркотиков или ген доставка, как полагают, улучшить в дальнейшем путем применения наночастиц в состоянии выпустить определенную лекарственную нагрузку в выбранных тканей.Занятость наночастиц также конкретные носители доставки и / или иммуномодуляторов для фармации требует знания биологической среды (т.е. через проточной цитометрии) для изучения клеток наночастиц взаимодействия.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Fondazione Istituto Italiano ди Tecnologia.
Авторы хотели бы выразить признательность Miltenyi Biotec GmbH (Бергиш-Гладбах, Германия) за спонсорскую этой рукописи, доктор Паоло Петручиани (Департамент Иммуно-гематологии и службы переливания, больницы Лотти Pontedera, Пиза, Италия) для обеспечения Баффи пальто человека и Профессор Массимо Паскуалетти (Биологический факультет – Единица Cellular и биологии развития, Университет Пизы, Пиза, Италия) для размещения колонии мыши.
HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |