الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي
Summary
تحليل التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا المناعية بواسطة التدفق الخلوي.
Abstract
وهبوا النانوية المهندسة مع خصائص واعدة جدا لأغراض علاجية وتشخيصية. يصف هذا العمل وسيلة سريعة وموثوق بها من تحليل التدفق الخلوي لدراسة التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع الخلايا المناعية. الخلايا المناعية الأولية يمكن تنقية بسهولة من الأنسجة البشرية أو الماوس عن طريق الأجسام المضادة التي تتوسط العزلة المغناطيسي. في المقام الأول، والسكان مختلفة من الخلايا تعمل في عداد الكريات تدفق يمكن تمييزها من الضوء إلى الأمام ومتناثرة (FSC)، والذي يتناسب مع حجم الخلية، وضوء متناثرة الجانب (SSC)، ذات الصلة إلى الخلية التعقيد الداخلي. وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة fluorescently المسمى ضد مستقبلات محددة سطح الخلية تسمح بتحديد عدة مجموعات سكانية فرعية داخل نفس العينة. في كثير من الأحيان، كل هذه الميزات تختلف عندما عزز الخلايا عن طريق مؤثرات الخارجية التي تتغير حالتها الفسيولوجية والمورفولوجية. هنا، 50 نانومتر FITC-شافي تستخدم 2 النانوية كنموذج لتحديد اله استيعاب المواد ذات البنية النانومترية في الخلايا المناعية في الدم البشري. مضان الخلية وزيادة خفيفة متفرقة الجانبية بعد الحضانة مع النانوية سمح لنا لتحديد الوقت والاعتماد تركيز التفاعل بين الخلايا جسيمات متناهية الصغر. وعلاوة على ذلك، ويمكن تمديد هذا البروتوكول للتحقيق رودامين-شافي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة 2 جسيمات متناهية الصغر الأولية، والخلايا المناعية العصبي المركزي نظام المقيمين، معزولة عن فئرانا معدلة وراثيا التي تعبر عن وجه التحديد بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في نسب الوحيدات / البلاعم. أخيرا، التدفق الخلوي وتأكدت البيانات المتعلقة جسيمات متناهية الصغر الداخلي في الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.
Introduction
المواد متناهية الصغر هندسيا والملهم في الوقت الحاضر اهتمام علماء الحياة عن التطبيقات المحتملة لالطب الحيوي 1. هناك طائفة واسعة من المواد العضوية وغير العضوية يمكن أن تستخدم لإنتاج النانو ذات أشكال مختلفة، والميزات المادية الكيميائية. بين هذه الهياكل، تظاهر النانوية المهندسة من الشكل الكروي إمكانات كبيرة للطب التشخيص ومتعدية 2. هي التي تحرك الأساسية وتصميم السطح قبل تطبيق ممكن، وأنه ينطوي على دراسة عميقة من استجابات الخلايا المستهدفة التالية جسيمات متناهية الصغر الاتصال والتفاعل. سوف النانوية التي يعتقد على أن تدار بشكل متعمد لمواضيع الإنسان تأتي في اتصال مباشر مع عدة أنواع من الخلايا المناعية. مسؤوليتهم للحفاظ على سلامة الجسم يجعلها موضوعا حيويا للتحقيق في لطب النانوي 3.
الجزء الخلوية في الجهاز المناعي الفطري تتمثل أساسا عن طريق البلعمة؛ الأكلcytes. فيما بينها، ونسب الوحيدات / بلعم الخلايا المشتقة، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة نظام العصبي المركزي، ولعب دورا رئيسيا في الدفاع المناعي 4،5. وهم قادرون على تحريك ردود وقائية في غضون ساعات قليلة بعد أن واجهت مع جهات أجنبية. علاوة على ذلك، خلايا الوحيدات تنسيق وإرشاد الاستجابة المناعية التكيفية من خلال الإفراج عن السيتوكينات. تحدث كل هذه الأحداث حتى في وجود مواد هندسيا، التي ينظر إليها إلى حد كبير "السوى" من قبل النظام المناعي 6.
من بين الأساليب المستخدمة في علم المناعة تاريخيا لتحليل الخلايا، والتدفق الخلوي تمثل واحدة من أقوى الأدوات. علاوة على ذلك، توفر تقنيات لتحديد أو تنقية جزء من السكان مناعية معينة (غالبا ما تستغل الاستبعاد أو وجود بروتين واحد غشاء واحد) يسمح التحقيق الدقيق للآثار جسيمات متناهية الصغر معينة على أن م الابتدائي خاصةنوع ليرة لبنانية 7. ومع ذلك، قد الخلايا تقديم التعديلات الفسيولوجية والمورفولوجية بعد التعرض للجزيئات. كذلك، قد النانوية تتداخل مع المعلمات البصرية محددة، مثل امتصاص أو انبعاث الضوء عند أطوال موجية محددة، والتأثير على النتائج المتحصل عليها 8. لذلك، ينبغي اعتبار حدود الاستخدام والتكيف في نهاية الأمر المقايسات المناعية الكلاسيكية لدراسة المواد الجديدة.
هذا العمل يتناول الكشف عن التفاعلات جسيمات متناهية الصغر مع الخلايا المناعية الأولية من قبل التدفق الخلوي. لمعالجة هذه المسألة، و 50 نانومتر FITC-شافي كانوا يعملون 2 النانوية على أنها نموذج المواد متناهية الصغر لوصف الأسلوب. يمكن أن تنتج جسيمات السيليكا بطريقة دقيقة جدا في مقياس النانو متري. الحجم والشكل، والسطح الخصائص، مثل تهمة أو للا مائية، يمكن ضبطها بدقة لزيادة توافق مع الحياة الخاصة بهم 9. العديد من الميزات من شافي 2 النانوية تسمح لهم أن تستخدمنموذج لتسليم المخدرات الجسيمات 10. وعلاوة على ذلك، والأصباغ الفلورية أو نقاط الكم يمكن شرك أو مرتبطة هذه الجسيمات تقديم المفيد نانو أدوات لأغراض التصوير 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم بروتوكول التجريبية نقطة حاسمة جدا أن تؤخذ بعين الاعتبار. من المهم حقا للعمل في 4 درجات مئوية (على الجليد)، وربما في الظلام خلال جميع الخطوات تلطيخ، بسبب ارتفاع درجات الحرارة والأضواء قد تؤثر سلبا على العائد تلطيخ. يمكن أن الجسيمات النانوية و sonicated معلق أفضل فقط قبل الاستخدام.
وتدفق تحليل الخلوي الصحيح يتطلب معايرة الصحيح في قنوات مختلفة. يجب أن يتم تنفيذ المعايرة الصك قبل كل دورة تجريبية. إلى جانب القضايا الفنية مع الأجهزة، ويمكن أن يكون هناك أيضا مشاكل مع وضع العلامات الأجسام المضادة. وهو إلزامي لاستخدام الأجسام المضادة في التركيز المناسب. إذا كان تركيز عالية جدا أو منخفضة جدا، يمكن أن شدة إشارة ديساتيسفيينج تكون العاقبة.
مساوئ هذا القلق تقنية الحاجة للعمل مع عينات monodisperse، وعدم القدرة على توطينموقع مصدر الإشارة (أي مقصورات الخلوية المختلفة). وهناك أيضا بعض القيود في اختيار fluorochromes لاستخدامها في تركيبة: الطول الموجي للإثارة ونطاقات الانبعاثات يجب فصل بما فيه الكفاية للسماح للقياس على النحو المناسب. إذا أطياف الأجسام المضادة المستخدمة تداخل، لا بد من التعويض الصحيح.
التدفق الخلوي هو وسيلة قوية لتحليل الخلية في وجود أو عدم وجود الجسيمات النانوية. يسمح هذا الأسلوب دراسة multiparametric لخلية، عددا كبيرا من الأحداث فحصها، سرعة تحليل (أكثر من 1،000 خلية / ثانية)، واستنساخ القراءات الإحصائية. يمكن معالجة العينات دون أن تفقد بقاء الخلية.
باستخدام جزيئات fluorescently المسمى فمن الممكن للتأهل وقياس استيعاب مجموعات سكانية فرعية في الخلية، والتي يتم تحديدها من قبل علامات محددة تعرض على غشاء الخلية. يمكن تغيير المعلمات الخلية في وجود ق النانوية pecific. اعتمادا على الهدف من البحث، وهذه الاختلافات يمكن أن تستخدم لتحديد ظاهرة معينة، مثل نثر الجانب من الخلايا التي يزيد نسبيا مع زيادة معدل استيعاب جسيمات متناهية الصغر.
التعديلات الناجمة عن جسيمات متناهية الصغر من سطح الخلية ويمكن أيضا تمثل الحد من هذه التقنية. لهذا السبب، يجب أن تؤخذ مستقبلات غشاء الخلية دوران دائما في الاعتبار وربما يعرف مقدما لتوصيف السكان الخلية الاهتمام على وجه التحديد. العاهات المدقع التناضح غشاء جسيمات متناهية الصغر في عينات زائد يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية.
سمية المواد متناهية الصغر التي تعتمد على الجرعة وينبغي اختبار تجريبيا لكل السكان الخلية. يجب استبعاد الخلايا الميتة واضحة المعالم من الكمي مضان. على سبيل المثال، Annexin V / PI تلطيخ هي واحدة من العديد من الأساليب المستخدمة عادة للكشف عن خلايا نخرية وأفكارك على حد سواء.
"> الخلايا الأولية، معربا عن GFP هي أيضا أداة قوية لتحديد جزء من السكان خلية معينة وجمع البيانات دون prelabeling. الجمع مع جزيئات الفلورسنت التكميلية يسمح الكمي سريع جدا ودقيق للتفاعل الخلايا جسيمات متناهية الصغر. ويعتقد المخدرات أو الجينات التسليم ل أن تتحسن في المستقبل من تطبيق النانوية قادرة على اطلاق سراح حمولة المخدرات محددة في الأنسجة المحددة.توظيف النانوية جهري كما محددة ناقلات التسليم و / أو المناعي للالصيدلة يتطلب معرفة البيئة البيولوجية (أي من خلال التدفق الخلوي) لدراسة التفاعلات الخلية جسيمات متناهية الصغر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل FONDAZIONE ISTITUTO ايطالي دي TECNOLOGIA.
فإن الكتاب أود أن أنوه بيوتيك Miltenyi محدودة (بيرجيش جلادباخ، ألمانيا) لرعاية هذه المخطوطة، والدكتور باولو Petrucciani (قسم أمراض الدم والمناعة خدمة نقل، مستشفى وتي بونتيديرا، بيزا، إيطاليا) لتوفير المعاطف الشهباء الإنسان و البروفيسور ماسيمو Pasqualetti (قسم الأحياء – وحدة الخلوي وعلم الأحياء التنموي، جامعة بيزا، بيزا، إيطاليا) لإسكان مستعمرة الماوس.
Materials
| HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
| Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
| Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
| CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
| Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
| Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
| MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
| FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
| Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
| 12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |
References
- Zhang, X. Q., et al. Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).
- Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Immunological properties of engineered nanomaterials. Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462, 449-460 (2009).
- Bertero, A., et al. Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia. Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).
- Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays. Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).
- Malvindi, M. A., et al. SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing. Nanoscale. 4, 486-495 (2012).
- Bardi, G. SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery. Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).
- Bardi, G., et al. The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance. Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
