Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

DICHIARAZIONE ETICA Campioni umani e animali sono stati trattati seguendo le linee guida del Ministero della Salute italiano, la legge 116/92 e della Direttiva Comunità Europea del Consiglio 86/609/CEE. 1. Culture Monocita cellulari Cultura umana THP-1 in cellule T-75 beute contenenti terreno RPMI-1640 integrato con 10% di siero umano, 50 U / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanolo a 37 ° C in 5% CO 2. Culture Split quando confluenti (ogni 3-5 giorni). 2. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da Buffy Coats Prima di iniziare il protocollo di isolamento, preparare una soluzione di tampone fosfato (PBS) pH 7,2, 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5% di siero albumina bovina (BSA), aggiungendo 5 ml BSA Stock Solution a 95 ml di risciacquo tampone (1: 20 diluizione). Degassarla buffer e mantenerlo freddo (2-8° C). IMPORTANTE: la mancata Degas buffer può provocare in meno rispetto ottimali risultati perché bolle possono bloccare la colonna di isolamento (vedere il punto 3.2). Nota: anticoagulante citrato destrosio formula-A (ACD-A) o destrosio fosfato citrato (CPD) può essere utilizzato in alternativa. Al contrario, altre proteine ​​albumina o sieri ottenuti da altre specie possono sostituire BSA. Non usare tamponi contenenti Ca 2 + o Mg 2 +. Ottenere buffy coats da donatori sani (età 20-60 anni). Preparare 50 ml provette coniche per la densità centrifugazione in gradiente. Determinare il numero di tubi necessari per l'elaborazione del sangue (ogni tubo può elaborare 35 ml di sangue diluito) e aggiungere 15 ml di Ficoll-Paque a ciascuna provetta vuota. Diluire 8 ml di sangue con 24 ml di PBS / BSA soluzione / EDTA (1:4 diluizione). Strato accuratamente la soluzione diluita in cima Ficoll-Paque (densità = 1.077 g / ml) in ciascuna delle 50 ml provette coniche. Non mescolareil sangue e Ficoll-Paque. IMPORTANTE: Per evitare la miscelazione del sangue e Ficoll-Paque, tenere il tubo ad angolo di 45 ° e sovrapporre la miscela sangue lentamente. Centrifugare a 400 xg per 30 min a 4 ° C. Le cellule mononucleate (MNC) rimarranno all'interfaccia plasma Ficoll-Paque, considerando che i granulociti ed eritrociti sedimenti a causa della maggiore densità alla pressione osmotica del Ficoll-Paque. Trasferire le cellule in interfase (Le cellule mononucleate del sangue, PBMC) in un tubo da 50 ml riempito con PBS / BSA / EDTA e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Lavare il pellet due volte con PBS / BSA / EDTA per rimuovere le piastrine. Spin a 200 xg per 10 min a 4 ° C. Cultura le cellule in completo RPMI-1640 con siero e antibiotici umano 10% o procedi alla monociti depurazione. 3. Purificazione di primaria monociti da PBMC Isolare monociti da PBMC mediante separazione magnetica tallone utilizzando Humun Pan Kit di isolamento dei monociti: Passare cellule attraverso una maglia di 30 micron di nylon (filtri preseparazione, 30 micron) per rimuovere eventuali grumi di cellule. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Sospensione cellulare centrifugare a 300 xg per 10 min a temperatura ambiente (RT). Aspirare il surnatante completamente. Risospendere il pellet cellulare in 30 ml di tampone PBS / EDTA / BSA per 10 7 cellule totali. Aggiungere 10 ml FcR Reagente Bloccante per 10 7 cellule totali. Aggiungere 10 ml di cocktail biotina-anticorpo per 10 7 cellule totali. Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 2-8 ° C. Aggiungere 30 ml di tampone per 10 7 cellule totali. Aggiungere 20 ml di anti-biotina microsfere per 10 7 cellule totali. Mescolare bene e incubare per 10 minuti a 2-8 ° C. Risospendere fino a 10 8 cellule in 500 microlitri di tampone PBS / EDTA / BSA. SEPAR magneticazione Di conseguenza il numero totale delle cellule, scegliere una colonna MACS appropriato e MACS separatore (vedi MACS colonna datasheet). Posizionare la colonna nel campo magnetico del separatore MACS. Preparare colonna sciacquando con la giusta quantità di tampone PBS / EDTA / BSA (colonne MS: 500 microlitri; colonne LS: 3 ml). Nota: Le colonne sono "Arresto flow" e non funzionare a secco. Applicare sospensione cellulare sulla colonna. Raccogliere flow-through contenente cellule senza etichetta, che rappresenta la frazione di monociti arricchito. Lavare colonna 3x con tampone PBS / EDTA / BSA (500 microlitri per MS e 3 ml per LS a lavaggio). Raccogliere le cellule senza etichetta che passano attraverso, in rappresentanza dei monociti arricchiti, e aggiungere al flusso continuo dalla sezione 3.2.4. Nota: Lavare la colonna con l'aggiunta di PBS / EDTA / BSA aliquote tampone solo quando il serbatoio colonna è vuota. (Facoltativo) Elimina colonna dalseparatore e posizionarlo su un tubo di raccolta adatto. Pipettare il tampone nella colonna (colonne MS: 1 ml; colonne LS: 5 ml). Sciacquare immediatamente le cellule nonmonocyte marcate magneticamente saldamente spingendo lo stantuffo nella colonna. Culture purificato monociti in completo RPMI-1640 con siero e antibiotici umano 10%. 4. Purificazione di primaria monociti da sangue intero Purificare monociti dal sangue intero utilizzando intero kit di isolamento dei monociti di sangue seguendo le istruzioni del produttore. 5. Nanoparticelle internalizzazione nel sangue leucociti e purificata monociti Tavola 5 x 10 5 cellule / ml (1 ml / pozzetto) dei PBMC isolati o le purificati monociti CD14 positivi in un 12-pozzetti. Vortex FITC-SiO soluzione stock 2 nanoparticelle e risospendere in mezzo completo ad una concentrazione di lavoro di 100 nm. Aggiungere 10 ml di nanop lavoraresospensione articolo (100 nM) per i campioni trattati per raggiungere una nanoparticella concentrazione finale di 1 nm. Aggiungere lo stesso volume di terreno completo per controlli non trattati in ciascun pozzetto. Dopo 1 ora internalizzazione raccogliere i campioni in una provetta di polipropilene da 1,5 ml e si centrifuga per 3 min a 6000 xga RT. Lavare il pellet con 1 ml di tampone di corsa 3 min a 6000 xga RT. Risospendere il pellet in 200 ml di tampone di corsa. Le cellule sono ora pronti per la lettura mediante citometria di flusso. 6. Isolamento dei primari Culture gliali miste (Vedi Bertero et al. 7) 7. Replating una cultura cellule gliali Confluent misto Lavare un pallone T-75 una volta con 10 ml di PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), quindi aggiungere 10 ml di Versene e incubare a 37 ° C per 5-7 min. Pipettare il supernatante su e giù diverse volte per staccare le cellule dalla superficie T-75 e sciogliereaggregati cellulari. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di polipropilene da 15 ml. Raccogliere una piccola quantità di sospensione cellulare per contare le cellule con un emocitometro. Centrifugare la sospensione di cellule per 5 minuti a 300 xg a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet ad una concentrazione finale di 5 x 10 5 cellule / ml in terreno di coltura completo gliale. Piatto 0,5 ml / pozzetto in una piastra a 24 pozzetti e lasciare che le cellule accontentarsi di 2-4 ore prima del trattamento delle nanoparticelle. 8. Nanoparticelle internalizzazione in Microglia Aggiungere 500 ml di mezzo completo di coltura gliale (per controlli non trattati) o 500 ml di una sospensione 2x rodamina-SiO 2 nanoparticelle in mezzo completo di coltura gliale (per campioni trattati) a ciascun pozzetto. Pipettare le cellule per permettere il distacco delle cellule nonrapid-aderente ai punti di tempo prescelti e raccoglierli in tubi di polipropilene 2 ml. Aggiungere 500 microlitridi Versene a ciascun pozzetto ed incubare la piastra a 37 ° C per 5 min, quindi staccare la frazione di cellule rimanenti e raccogliere ogni campione con le corrispondenti cellule nonadhering del passo precedente. Centrifugare i campioni per 3 min a 300 xg a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 100 ml di AutoMACS tampone di corsa. 9. Colorazione con CD11b-VioBlue Aggiungere 10 ml di VioBlue-CD11b anticorpo umano / mouse per 100 ml di sospensione cellulare (01:11 ratio) in tampone di corsa e incubare 10 min a 4 ° C. Aggiungere 1 ml di tampone di corsa e miscelare la sospensione cellulare. Centrifugare ogni campione per 3 min a 300 x g. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 100-150 ml di tampone di corsa. Leggere i campioni al citometro (conservare i campioni a 4 ° C tra gli ultimi due passaggi). IMPORTANTE: prima di analizzare i campioni, procedere alla compensazione dei segnali sovrapposti iGli spettri di emissione n osservata tra i diversi fluorocromi (nanoparticelle o anticorpi fluorocromo coniugato). 10. Spill Spectral Oltre Compensation Aprire il dialogo "Impostazioni dello strumento" (presente in tutti i programmi software strumento). Nota: Se si utilizza uno strumento diverso da quello riportato nella tabella Materiale, fare riferimento al manuale specifico strumento per i particolari di acquisizione. Acquisire campione non trattato (senza nanoparticelle) a bassa velocità fluido (se consentito dallo strumento). Durante l'acquisizione, regolare manualmente l'ora e la dispersione laterale (FSC e SSC, rispettivamente) regolando i canali di tensione. Nota: Modificare le scale degli assi SSC e FSC per visualizzare al meglio la popolazione cellulare completo nella trama. Una impostazione di template per ogni tipo di cellula di interesse strumento può essere creato, salvata e utilizzata per future acquisizioni. Aprire la specificaScheda "regione" nel software. Disegnare una regione grande appropriata ("gate") in giro per la popolazione desiderata. Nota: internalizzazione delle nanoparticelle induce uno spostamento SSC delle cellule. Se il cancello è troppo strettamente limitato intorno alla popolazione di cellule, i dati acquisiti saranno probabilmente perdere parte delle cellule da rilevare. Utilizzare due campioni non colorati, uno per l'uso come campione in bianco e una per risarcimento contro PI colorazione (opzionale), un campione unico tinto con il fluorocromo appropriata per ogni canale di fluorescenza di essere risarciti. Nota: utilizzare un diverso tubo campione 1,5 ml per ciascuna di anticorpi coniugati da utilizzare nell'etichettatura esperimento. Aprire la scheda "compensazione" nella casella "Impostazioni strumento". Aumentare o diminuire il fattore di compensazione in sede di acquisizione fino a quando l'intensità di fluorescenza nel canale spillover è più o meno lo stesso per la pos fluorocromoitive e la popolazione negativo. Acquisire campioni di nanoparticelle trattati dopo la compensazione è stata regolata.