Summary

Пептиды: MHC тетрамеров на основе обогащения эпитопов Т-клеток

Published: October 22, 2012
doi:

Summary

Этот протокол описывает использование пептидов: MHC тетрамеров и магнитных микросфер, чтобы изолировать низкой популяции частота эпитопов Т-клеток и их анализ с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет непосредственное изучение эндогенных T клеточных популяций интерес со стороны<em> В естественных условиях</em> Экспериментальных систем.

Abstract

Первой необходимости для исследователей, изучающих адаптивного иммунитета в естественных условиях экспериментальной модели является способность идентифицировать Т-клеток в зависимости от их рецепторов Т-клеточного антигена (TCR) специфичность. Многие косвенные методы доступны, в которых большая часть популяции Т-клеток стимулируется в пробирке со специфическим антигеном и эпитоп-специфических Т-клеток, определяются с помощью измерения функционального ответа, таких как пролиферация, продукции цитокинов, или экспрессия маркеров активации 1. Однако, эти методы только определить эпитоп-специфических Т-клеток с одним из многих возможных функций, и они не достаточно чувствительны, чтобы обнаружить эпитоп-специфических Т-клеток на наивных частоты предшественника. Популярной альтернативой является TCR трансгенных приемных модель передачи, в которых моноклональных Т-клеток от мышей TCR трансгенных высевают в гистосовместимого хостов для создания большого населения предшественник эпитоп-специфических Т-клеток, которые могут быть EASIют отслеживается с использованием антител конгенных маркер 2,3. В то время как мощные, этот метод страдает от экспериментальных артефактов, связанных с нефизиологические частота Т-клеток со спецификой для одного эпитопа 4,5. Кроме того, эта система не может быть использован для исследования функциональной гетерогенности эпитоп-специфических Т-клеточных клонов в поликлональных населения.

Идеальный способ для изучения адаптивного иммунитета должны предусматривать прямое обнаружение эпитоп-специфических Т-клеток от эндогенных репертуара Т-клеток, используя метод, который отличает специфичность TCR исключительно его связывание с родственными пептид: MHC (ПКИКЖ) комплексов. Использование ПКИКЖ тетрамеров и проточной цитометрии решает эту задачу 6, но ограничен обнаружения высокой частотой населения эпитоп-специфических Т-клеток можно найти только следующие антиген-индуцированной клональной экспансии. В этом протоколе, мы опишем метод, который координирует использование тетрамеров ПКИКЖ и Магнетик клетке технологии обогащения позволяют обнаружить крайне низкой частоты эпитоп-специфических Т-клеток от мышей лимфоидной ткани 3,7. С помощью этого метода, можно всесторонне отслеживать весь эпитопа конкретных популяций эндогенных Т-клеток у мышей на всех этапах иммунного ответа.

Protocol

1. Сотовые Изоляция от лимфоидной ткани Добавить 1 мл ледяной cEHAA (EHAA + 10% FBS, ручки / стрептококк, гентамицин, 2 мМ L-глутамина, 55 мМ 2-меркаптоэтанола) или другим эквивалентным средних Т-клеток, на 60 мм культуры блюдо с небольшой площадью 100 мкм, нейлоновая сетка и место на льду. Усып…

Representative Results

На рисунке 1 показана представитель проточной цитометрии участков pMHCII тетрамер обогащенных образцов селезенки и лимфатических узлов от наивных мышей, а на рисунке 2 показаны репрезентативные данные для мышей, иммунизированных ранее с соответствующим пептидом + CFA. С?…

Discussion

ПКИКЖ тетрамера на основе метода обогащения клетки представленные этого протокола является мощным инструментом для изучения эпитоп-специфических Т-клеток от эндогенных T репертуар клетки. Использование тетрамеров ПКИКЖ позволяет обнаруживать эпитоп-специфических Т-клеток основан ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Андре Хан и Лоуренс иен для оказания технической помощи, а также члены Дженкинс лаборатории за помощь в развитии этого протокола.

Materials

Reagent Vendor Catalog number
PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources
Anti-PE conjugated magnetic microbeads Miltenyi 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic microbeads Miltenyi 130-090-855
LS magnetic columns Miltenyi 130-042-401
MidiMACS or QuadroMACS magnet Miltenyi 130-042-302 or 130-090-976
Cell counting beads Life Technologies PCB-100

References

  1. Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
  2. Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
  3. Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
  4. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  5. Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
  7. Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
  8. Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
  10. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  11. Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
  12. Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
  13. Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
  14. Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
  15. Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
  16. Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
  17. Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
  18. Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
  19. Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
  20. Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
  21. Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).

Play Video

Cite This Article
Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. (68), e4420, doi:10.3791/4420 (2012).

View Video