Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von Interesse<em> In vivo</em> Experimentellen Systemen.
Abstract
Eine Grundvoraussetzung für die Forscher studieren adaptiven Immunität in vivo experimentellen Modellen ist die Fähigkeit, T-Zellen auf ihren T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Spezifität zu identifizieren. Viele indirekte Methoden zur Verfügung, in denen ein Schüttgut Population von T-Zellen in vitro mit einem Antigen und Epitop-spezifischer T-Zellen werden durch die Messung einer funktionalen Antwort wie Proliferation, Zytokinproduktion, oder Expression der Aktivierungsmarker 1 identifiziert wird angeregt. Jedoch sind diese Methoden nur identifizieren Epitop-spezifischen T-Zellen, die eine von vielen möglichen Funktionen, und sie sind nicht empfindlich genug, um Epitop-spezifischer T-Zellen bei naiven Vorstufe Frequenzen zu detektieren. Eine beliebte Alternative ist die TCR-transgene adoptiven Transfer Modell, in dem monoklonalen T-Zellen aus einem transgenen Maus TCR in histokompatiblen Hosts ausgesät, um eine große Population von Vorläufer-Epitop-spezifische T-Zellen, die easi sein könnenly mit der Verwendung eines kongenen Markerantikörper 2,3 nachverfolgt. Wenn leistungsfähig leidet dieses Verfahren aus experimentellen Artefakte mit der unphysiologischen Häufigkeit von T-Zellen mit einer Spezifität für ein einzelnes Epitop 4,5 zugeordnet. Darüber hinaus kann dieses System nicht verwendet, um die funktionelle Heterogenität der Epitop-spezifische T-Zell-Klone in einer polyklonalen Population untersuchen.
Der ideale Weg zur adaptiven Immunität studieren sollte den direkten Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen aus dem endogenen T-Zell-Repertoire mit einer Methode, TCR Aspekt unterscheidet ausschließlich durch dessen Bindung an cognate Peptid: MHC (pMHC)-Komplexe. Die Verwendung von Tetrameren pMHC und Durchflusszytometrie erreicht dieses 6, jedoch wird auf die Erfassung von hochfrequenten Populationen von Epitop-spezifischer T-Zellen nur gefunden folgenden antigeninduzierte klonale Expansion begrenzt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, die die Verwendung von pMHC Tetramere koordiniert und magnetic Zellanreicherung Technologie, um Erkennung von extrem niederfrequenten Epitop-spezifischer T-Zellen aus der Maus Lymphgewebe 3,7. Mit dieser Technik kann ein umfassender verfolgen gesamte epitopspezifischen Populationen von endogenen T-Zellen in Mäusen in allen Stadien der Immunantwort.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die pMHC Tetramer basierte Anreicherung von Zellen-Methode von diesem Protokoll vorgestellt ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Epitop-spezifischer T-Zellen aus körpereigenen T-Zellen Repertoires. Die Verwendung von Tetrameren pMHC ermöglicht Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen direkt auf die Fähigkeit ihrer TCRs auf artverwandten pMHC Liganden binden. Die Anreicherung stellt einen Grad der Empfindlichkeit derart, dass extrem selten Populationen von Antigen-spezifischen T-Zellen aus endogenen Repert…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Andre Han und Lawrence Yen für die technische Unterstützung, und die Mitglieder der Jenkins Labor für Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls danken.
Materials
| Reagent | Vendor | Catalog number |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | |
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
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