Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats van<em> In vivo</em> Experimentele systemen.
Abstract
Een basisvereiste voor onderzoekers die met adaptieve immuniteit in vivo experimentele modellen is het vermogen om T-cellen op basis van hun T-cel antigen receptor (TCR) specificiteit identificeren. Veel indirecte methoden beschikbaar waarin een bulk populatie van T-cellen wordt gestimuleerd in vitro met een specifiek antigeen en epitoop-specifieke T-cellen worden geïdentificeerd door het meten van een functionele reactie zoals proliferatie, cytokine productie of expressie van merkers van activering 1. Echter, deze methoden alleen identificeren epitoopspecifieke T-cellen vertonen een van de vele functies en zijn niet gevoelig genoeg om epitoop-specifieke T-cellen te detecteren op naïeve precursor frequenties. Een populair alternatief is de TCR transgene adoptieve transfer model, waarbij monoklonale T-cellen van een TCR transgene muizen worden geënt in histocompatibel hosts een groot precursor populatie van epitoop-specifieke T-cellen die kunnen worden EASI creërenly gevolgd met behulp van een antilichaam congenische marker 2,3. Terwijl krachtige Deze werkwijze heeft experimentele artefacten die met de niet-fysiologische frequentie van T-cellen met specificiteit voor een epitoop 4,5. Bovendien kan dit systeem niet worden gebruikt om de functionele heterogeniteit van epitoop-specifieke T cel klonen te onderzoeken binnen een polyklonale populatie.
De ideale manier om adaptieve immuniteit bestuderen dienen onder directe detectie van epitoopspecifieke T-cellen van het endogene T-cel repertoire volgens een methode die TCR specificiteit onderscheidt uitsluitend door haar binding aan verwant peptide: MHC (pMHC) complexen. Het gebruik van pMHC tetrameren en flowcytometrie volbrengt deze 6, maar is beperkt tot het opsporen van hoogfrequente populaties van epitoopspecifieke T-cellen aangetroffen volgende antigen geïnduceerde klonale expansie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze die het gebruik van pMHC tetrameren coördineert en magnesiumtic cel verrijkingscocktail technologie voor de detectie van extreem lage frequentie epitoopspecifieke T-cellen van muizen lymfoïde weefsels 3,7 toestaat. Met deze techniek kan men volledig volgen gehele epitoopspecifieke populaties van endogene T-cellen in muizen in alle stadia van de immuunrespons.
Protocol
Representative Results
Discussion
De pMHC tetrameer gebaseerde mobiele verrijking methode die door dit protocol is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van epitoop-specifieke T-cellen van endogene T-cel repertoire. Het gebruik van pMHC tetrameren maakt detectie van epitoopspecifieke T-cellen rechtstreeks gebaseerd op het vermogen van de TCR aan cognate pMHC liganden binden. De verrijking een niveau van gevoeligheid zodat uiterst zeldzame populaties van antigeen-specifieke T-cellen kunnen gedetecteerd worden uit repertoires van endogene T-cellen z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Andre Han en Lawrence Yen voor technische bijstand, en leden van de Jenkins lab bedanken voor hulp bij de ontwikkeling van dit protocol.
Materials
| Reagent | Vendor | Catalog number |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | |
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
References
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
