Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T
Summary
Questo protocollo descrive l'uso del peptide: MHC tetrameri e microsfere magnetiche per isolare popolazioni bassa frequenza di epitopo-specifiche cellule T e analizzarli mediante citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio diretto delle popolazioni di cellule T endogene di interesse da<em> In vivo</em> Sistemi sperimentali.
Abstract
Una necessità di base per i ricercatori che studiano immunità adattativa con modelli sperimentali in vivo è la capacità di identificare cellule T in base al loro recettore antigene sulla cellula T (TCR) specificità. Molti metodi indiretti sono disponibili in cui una popolazione di cellule T bulk è stimolata in vitro con un antigene specifico epitopo-specifici e le cellule T sono identificati mediante la misurazione di una risposta funzionale come proliferazione, produzione di citochine, o l'espressione di marcatori di attivazione 1. Tuttavia, questi metodi solo identificare epitopi specifici per cellule T presentano una delle tante possibili funzioni, e non sono sufficientemente sensibili per rilevare le cellule T epitopo-specifici a frequenze precursori naive. Un'alternativa popolare è il modello transgenico trasferimento TCR adottiva, in cui le cellule T monoclonali da un topo transgenico TCR sono seminati in istocompatibili host per creare una vasta popolazione precursore di epitopo-specifiche cellule T che possono essere facilly cingolato con l'uso di un anticorpo marcatore congenic 2,3. Mentre potente, questo metodo soffre di artefatti sperimentali associate alla frequenza fisiologica di cellule T con specificità per un singolo epitopo 4,5. Inoltre, questo sistema non può essere usato per studiare l'eterogeneità funzionale di epitopo-specifici cloni di cellule T all'interno di una popolazione policlonale.
Il modo ideale per studiare l'immunità adattativa dovrebbe coinvolgere il rilevamento diretto di cellule T epitopo-specifici del repertorio endogeno delle cellule T utilizzando un metodo che distingue la specificità TCR esclusivamente dal suo legame con l'affine peptide: MHC (pMHC) complessi. L'utilizzo di tetrameri pMHC e citometria di flusso realizza questo 6, ma è limitata alla rilevazione di popolazioni ad alta frequenza di epitopo-specifiche cellule T solo trovati seguente indotta da antigene espansione clonale. In questo protocollo, si descrive un metodo che coordina l'uso di tetrameri pMHC e magnetecnologia delle celle tic arricchimento abilitare il rilevamento di frequenza estremamente bassa epitopo-specifiche cellule T di topo tessuti linfoidi 3,7. Con questa tecnica, si può globalmente intera traccia epitopo-specifiche popolazioni di cellule T endogene in topi in tutte le fasi della risposta immunitaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il pMHC tetramero metodo basato arricchimento delle cellule presentata da questo protocollo è un potente strumento per lo studio delle cellule T epitopo-specifici di cellule T endogene repertori. L'utilizzo di tetrameri pMHC consente il rilevamento di epitopo-specifiche cellule T basati direttamente sulla capacità dei loro TCR per legare ligandi affini pMHC. L'arricchimento fornisce un livello di sensibilità in modo tale che le popolazioni estremamente rari di antigene-specifiche cellule T può essere rilevat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Andre Han e Yen Lawrence per l'assistenza tecnica, ed i membri del laboratorio Jenkins aiuto per lo sviluppo di questo protocollo.
Materials
| Reagent | Vendor | Catalog number |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | |
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
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