였죠 셀 유형 – 특정 단백질 현지화 및 nucleocytoplasmic의 특성화를위한 유연하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 heterokaryon 접근은 세포 융합 후 이미지 단백질 localizations에 찬란 – 표시 융합 단백질을 사용합니다. 프로토콜은 정상 상태 localizations 또는 라이브 셀 이미징을 기반으로보다 역동적인 결정 의무가 있습니다.
단백질의 상당수는 subcellular 매매 또는 였죠 nucleocytolasmic에 의해 규제됩니다. 이러한 단백질은 핵 수입 / RNA와 단백질의 수출, transcriptional 규제 및 apoptosis를 포함한 세포 기능의 다양한 배열을 표시합니다. 흥미롭게도, 세포 분열, 분화 및 변형 등 주요 휴대폰 reorganizations는 종종 그러한 활동을 할 3,4,8,10를 포함. 이러한 단백질과 해당 규제 메커니즘의 상세한 연구는 이러한 현지화 변경 기묘한 수에 대한 자극하고, 스스로 추적하는 매우 역동적이고 어려울 수있는 움직임으로 도전하실 수 있습니다. 세포 oncogenesis과 관련된 연구는 예를 들어, 이해의 경로와 정상 세포 및 기본 세포 변형 6,7,11,12 다를 단백질 활동의 혜택을 계속합니다. 많은 단백질은 변경 변형 동안이나 변환의 결과로 현지화 효율적으로이 단백질을 특성화 방법과 그들이 마약 타겟팅 oncogenesis 및 오픈 새로운 영역에 대한 이해를 향상시키기 위해 서 참여하는 경로를 보여으로.
여기 단백질 인신 매매의 분석을위한 방법을 제시하고 기본 및 변형 포유 동물 세포 사이의 활동을 였죠. 이 방법은 정상 상태 또는 동적 단백질 localizations를 감지하는 데 사용할 수있는 유연한 프로토콜을 제공하기 위해 형광 현미경과 heterokaryon의 fusions의 생성을 결합한 제품입니다. 그림 1과 같이, 두 개의 세포 종류 transiently 관심의 유전자에 부착된 fluoroprotein의 유전자를 플라스미드 베어링 구성과 transfected 있습니다. 표현 후, 전지는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 융합하고, 단백질 localizations 그런 다음 다양한 방법을 사용하여 몇 군데있을 수 있습니다. 여기에 제시 프로토콜은 전문 기술이 추가될 수도 있습니다에 대한 근본적인 접근 방식이다.
heterokaryon 프로토콜은 세포 유형의 특정 현지화 행동뿐만 아니라 nucleocytoplasmic 였죠 활동의 특성화를위한 효율적이고 쉽게 interpretable 방법을 제공 여기를 발표했다. 이 방법은 형광 분석의 감도뿐만 아니라 기능 영상 라이브 세포와 단백질 역학 연구를 수행을 활용합니다. 기술은 쉽게 다양한 세포 유형에 적응하고 생활하고 고정 세포 이미징 모두 의무입니다. 예를 들어, 거꾸로 형광 현미경은 라이브 이미징 및 시간 저속 비디오 캡처에 사용할 수 있습니다. 반대로, 탑재 전지가 정상 상태 localizations 또는 개별 localizations의 상세한 공촛점 이미징의 결정 모두에 대해 epifluorescence 현미경에 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 photobleaching 후 형광 복구 (FRAP) 또는 photobleaching에 형광 손실 (플립)와 같은 기술은 현지화 속도론 1의 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 대체 fluorophores의 결합 콘서트 2 수행하는 형광 공명 에너지 전달 (무서워) 같은 단백질 상호 작용 실험을 허용합니다. 이러한 leptomycin의 B 또는 부정적인 지배와 같은 세포 인신 매매의 다양한 억제제는 GTPase 구성 요소가 특정 가져 오거나 내보내기 경로 5,6,9에 의존을 확립하는 데 사용할 수있는 랜.
The authors have nothing to disclose.
우리는 자금에 대한 화학 생화학의 우스터 폴리 테크닉 연구소 부서를 감사드립니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Effectene reagent | Qiagen | 301425 | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | ||
Trypsin | Fisher | SH3023602 | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher | SH30243FS | High glucose | |
paraformaldehyde | FisherChemical | O4042-500 | ||
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | ||
Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Scientific | SH3008803HI | ||
Falcon 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | ||
Polyethylene glycol 1000 | Fisher | 528875-25GM | ||
Cover slips | Fisher | 12-545-85 | ||
DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | ||
Nucleofector HDF kit | Lonza | VPD-1001 |