Tecnica Heterokaryon per l'analisi di cellule tipo-specifica localizzazione

1. Trasfezione di linee cellulari Transfection Metodo 1 (Nucleofection Lonza per una maggiore efficienza di trasfezione delle cellule primarie) Le cellule devono essere di passaggio recente e in crescita log fase prima di trasfezione. Lavare le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e le cellule raccolta da tripsinizzazione. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1500 xg per 5 minuti. Aggiungi scivola copertura sterile per un 6-pozzetti. Scivola la copertura può essere rivestita per l'adesione cellulare migliorata. Luogo 1,5 mL di terreni di coltura (in questo caso medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS)) in ciascun pozzetto ed equilibrare i media nell'incubatrice. Raccogliere le cellule tripsinizzazione e risospendere in un volume minimo di tampone fosfato (PBS). Contare le celle e centrifugare la giusta quantità di risospensione di fornire ~ 5×10 5 cellule per campione. Risospendere le cellule con cura in 100 ul soluzione Nucleofector temperatura ambiente per campione. Combina 100 l di sospensione cellulare con 5 mg di DNA plasmidico e trasferimento del campione ad un Cuvette Nucleofector facendo attenzione a non includere bolle d'aria. Selezionare il programma appropriato Nucleofector (questo potrebbe richiedere test precedenti di stabilire l'efficienza ottimale di trasfezione con mortalità minima). Inserire la cuvetta contenente la cella / DNA sospensione nella portacuvette Nucleofector e avviare il programma selezionato. Al termine, rimuovere la cuvetta e aggiungere circa 500 ml di pre-equilibrato terreni di coltura ad esso (tratto dal 6 pozzetti). Trasferire immediatamente il campione in 6 pozzetti con volume finale di 1,5 mL per pozzetto. Le cellule devono essere placcato in entrambe le popolazioni miste o separatamente, per i controlli. Trasfezione Metodo 2 (Qiagen trasfezione Effectene per linee cellulari) Preparare complessi trasfezione utilizzando il reagente Qiagen Effectene in primo luogo l'aggiunta di 0,8 mg di ciascun campione di DNA plasmidico a 200 microlitri di buffer CE. Aggiungere 6,4 microlitri di reagente enhancer a ciascun campione, miscelare brevemente muovendo il tubo, e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 20 microlitri di reagente Effectene ad ogni mix campione, muovendo il tubo, e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Durante questa incubazione, preparare le due linee cellulari di interesse per la trasfezione. Lavare le cellule recentemente diversi passaggi (<80% confluenza), una volta in tampone fosfato (PBS). Aggiungi nuovo mezzo fresco 1,5 ml di crescita equilibrata e riscaldato (in questo caso medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS)). Una volta che i complessi trasfezione hanno incubato per 15 minuti, trasferire 1,2 ml di media per ogni campione. Mescolare pipettando, e trasferire immediatamente ~ 700 ml di complessi a ciascuno dei due pozzi nel 6 pozzetti. Aggiungere goccia a goccia, e mescolare delicatamente facendo roteare il piatto. Consentono alle cellule di trasfezione per almeno 3 ore (può variare con il tipo di cellula). Aggiungi scivola copertura sterilizzati ad un nuovo cambio a 6 pozzetti. Scivola la copertura può essere rivestita per l'adesione cellulare migliorata. Dopo che le cellule sono transfettate, lavare le cellule due volte con PBS e raccogliere le cellule trysinization minimo con l'aggiunta di circa 100 microlitri soluzione tripsina in ogni pozzetto, agitare brevemente la piastra a cappotto completamente ogni bene, e subito aspirando la tripsina. Una volta che le cellule hanno sollevato, aggiungere 1,5 mL di mezzi freschi. A questo punto, le cellule devono essere placcato in popolazioni mista o separata (per i controlli) sul coprioggetto sterili. Consentono alle cellule di recuperare per 12 ore. 2. Fusione cellulare Togliere terreni di coltura dalle cellule e lavare due volte con PBS. A questo punto, si consiglia di trattare le cellule con cicloesimide (100 mg / ml) per inibire la sintesi proteica. Consentire alle cellule di incubare per 2 ore e poi lavare le cellule due volte con PBS. Cellule fusibile esponendoli ad una soluzione del 50% polietilenglicole 1000 (PEG 1000) in DMEM senza siero per 125 secondi a temperatura ambiente. Lavare le cellule con PBS per rimuovere la soluzione di PEG 1000, e aggiungere 2 mL appena scaldato e media equilibrata. Consentono alle cellule ad incubare per 18 – 24 ore. Microscopia a fluorescenza Rimuovere i terreni di coltura, e lavare le cellule due volte in PBS. Fissare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% (in PBS) in ogni pozzetto. Agitare delicatamente per 15 minuti. Lavare le cellule fissate due volte in PBS. Rimuovere con cautela il coperchio scivola dalla piastra, stoppino in eccesso PBS. Inverti sul microscopio diapositive caricato con una goccia di mezzo di montaggio (90% glicerolo, 100mM Tris pH 7.5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-ottano) contenente DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindolo). Rimuovere l'eccesso di mezzo di montaggio di diapositive, e sigillare cover scivola con smalto. Visualizzare le cellule mediante microscopia confocale o epifluorescenza. 3. Rappresentante Risultati La Figura 2 mostra un esperimento heterokaryon esempio utilizzando fibroblasti primari e H1299 non a piccole cellule cellule di carcinoma del polmone. La proteina di interesse in questo esperimento (Anemia di pollo Virus-VP3) mostra la localizzazione citoplasmatica principalmente in tipi di cellule primarie e di localizzazione nucleare in tipi di cellule trasformate come visualizzato mediante microscopia in epifluorescenza. La proteina è espressa come fusione di due GFP (pEGFP-N1 vettore, Clontech) nei fibroblasti prepuzio primaria (PFF) o DsRed (DsRed-N1 vettore, Clontech) nelle cellule H1299. Campioni di controllo che coinvolge auto-fusioni (prime due righe) Display cellule multinucleate con nessun cambiamento nella steady-state modelli di localizzazione. Tali cambiamenti potrebbero altrimenti verificarsi a causa di sensibilità alle condizioni fusione o la formazione di sincizi. Fusioni Heterokaryon (riga in basso) dimostrano ingresso nucleare della GFP-fuso primario derivati ​​dalle cellule e proteine ​​colocalizzazione con la DsRed-proteina fusa in risposta alla introduzione di materiale cellula trasformata. L'esempio mostrato è una fusione heterokaryon relativamente rara risultante da due sole cellule, uno di ogni tipo, come dimostra la presenza di entrambi i segnali fluoroprotein. Oltre a rilevare questi tipi di transizioni di localizzazione, nucleocytoplasmic attività spola possono essere facilmente individuati dalla presenza di un fluoroforo in questi due nuclei. Questo tipo di dosaggio è chiaro in sede di esame 01:01 la fusione di cellule e dipenderà dalla inibizione della traduzione. Figura 1. Diagramma di flusso del metodo heterokaryon utilizzando fibroblasti primari e H1299 non a piccole cellule di carcinoma. Il gene di interesse viene clonato per produrre un telaio in fusione di uno dei due geni delle proteine ​​fluorescenti. Linee cellulari sono poi transitoriamente trasfettate sia con il permesso di costruire e recuperare. Formazione Heterokaryon è indotta dal trattamento breve con polietilene glicole (PEG), seguita da incubazione ulteriormente. Infine, la localizzazione sub-cellulare della proteina di interesse viene osservata utilizzando varie forme di microscopia a fluorescenza. Figura 2. Traffico Nucleocytoplasmic e spola attività della proteina di pollo Anemia Virus VP3 visualizzati da fusione heterokaryon. Riga superiore: immagini rappresentative di auto-H1299 fuso cellule che esprimono DsRed-VP3 fila Oriente:.. Rappresentante immagini epifluorescenza di cellule primarie di fibroblasti prepuzio (PFF) che esprime GFP-VP3 dopo la fusione PEG fila in basso: la fusione Heterokaryon di TFP e H1299 cellule. Giallo indica colocalizzazione di GFP e segnali DsRed. Le cellule sono state ripreso usando una Leica AF6000E microscopio a fluorescenza Leica e software di imaging.