Hücre Tipi özel Yerelleştirme Analizi için Heterokaryon Tekniği
Summary
Mekik hücre tipine spesifik protein yerelleştirme ve Nükleositoplazmik karakterizasyonu için esnek ve verimli bir yöntem açıklanmıştır. Bu heterokaryon yaklaşım görüntü protein lokalizasyonu hücre füzyonu sonra floresan etiketli füzyon proteinleri kullanır. Protokol kararlı durum lokalizasyonu veya canlı hücre görüntüleme dayalı daha dinamik tespitler mükellef.
Abstract
Önemli bir sayıda proteinler, hücre içi ticareti veya nucleocytolasmic mekik tarafından düzenlenir. Bu proteinler, RNA ve protein nükleer ithalat / ihracat, transkripsiyonal yönetmelik, ve apoptosis gibi hücresel fonksiyonları çeşitli bir dizi gösterir. İlginçtir, hücre bölünmesi, farklılaşma ve dönüşüm de dahil olmak üzere önemli hücresel yeniden yapılanma, sık sık bu tür faaliyetler 3,4,8,10 içerir. Bu proteinlerin ve kendi düzenleyici mekanizmaların detaylı bir çalışma bu lokalizasyon değişiklikleri zor olabilir uyarılması ve kendilerini izlemek için oldukça dinamik ve zor olabilir hareketleri gibi zor olabilir. Hücresel karsinojeneze içeren çalışmalar, örneğin, anlayış yollar ve birincil, normal hücreleri ve transforme hücreleri 6,7,11,12 arasında farklılık protein aktiviteleri yararlanmaya devam. Birçok protein değişmiş dönüşümü sırasında veya lokalizasyonu, dönüşümün bir sonucu olarak verimli bir şekilde bu proteinlerin karakterize etmek için yöntemler ve ilaç hedef karsinojeneze ve açık yeni alanlar anlayışı geliştirmek stand katıldığı yollar gösterir.
Burada protein ticareti analizi için bir yöntem mevcut ve birincil ve transforme memeli hücreleri arasındaki aktivite mekik. Bu yöntem, kararlı durum ya da dinamik protein lokalizasyonu tespit etmek için kullanılan esnek bir protokol sağlamak için floresan mikroskobu ile heterokaryon füzyonlar nesil birleştirir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, iki ayrı hücre tipleri geçici ilgi gen bağlı bir Fluoroprotein geni taşıyan plazmid yapıları ile transfekte. Ifade sonra, hücreler polietilen glikol kullanarak erimiş ve protein lokalizasyonu daha sonra çeşitli yöntemler kullanarak görüntülü olabilir. Burada sunulan protokol, özel teknikler ilave edilebilir temel bir yaklaşımdır.
Protocol
Discussion
Burada sunulan heterokaryon protokol hücre tipine spesifik lokalizasyon davranış yanı sıra Nükleositoplazmik mekik faaliyet karakterizasyonu için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yöntem, floresan analizi duyarlılık yanı sıra yetenek görüntü canlı hücreleri ve protein dinamiği çalışmaları gerçekleştirmek yararlanır. Tekniği, pek çok farklı hücre tipleri için kolayca adapte ve hem canlı ve sabit hücre görüntüleme için uygun. Örneğin, ters floresan mikroskopi canlı görüntüleme ve zaman atlamalı video yakalama için kullanılabilir. Buna karşılık, kararlı durum lokalizasyonu veya ayrık lokalizasyonları daha ayrıntılı konfokal görüntüleme belirlenmesi için iki Epifloresans mikroskopi monte hücreleri kullanılıyor olabilir. Ayrıca, bu tür photobleaching sonra floresan kurtarma (sıkı bağlamak), ya da floresan photobleaching içinde kaybı (FLIP) gibi teknikler, lokalizasyon kinetiği 1 tespitinde kullanılabilir . Protokol alternatif fluorophores birleşme 2 konser yapılacak floresan rezonans enerji transferi (FRET) gibi protein etkileşim deneyler için izin verecek. Leptomycin B veya olumsuz egemen olarak hücresel ticareti Çeşitli inhibitörleri Ran GTPaz yapıları, özellikle ithalat veya ihracat yollar 5,6,9 bağımlılığı kurmak için kullanılabilir .
- Faaliyet mekik içeren bazı deneylerde, bakım, yeni protein sentezi nedeniyle yerelleştirme etkilerinden kaçınmak için gerekli önlemler alınmalıdır. Bu durumlarda, çeviri inhibitörleri veya sınırlı bir süre noktaları kullanılmalıdır. Ancak, bir olasılık translasyonel inhibisyonu nedeniyle eserler kalır. Biri Hücre füzyonlar her hücre tipi içeren, mekik ve yerelleştirme davranışı net yorumlanması için en çok istenen. Hücre sayısı ve füzyon koşulları (zamanlama ve konsantrasyon) optimizasyonu tür olumlu 01:01 füzyon olayları teşvik etmek için gerekli olabilir.
- Protokol bazı adımlar bu optimizasyon kullanılan özel hücre tipleri bağlı olarak gerekli olacaktır dikkat etmek önemlidir. Füzyon etkinlik, Transfeksiyonu verimlilik ve füzyon sonra canlılığını deneysel işlemin Yönleri hücre tipleri arasında büyük farklılık gösterebilir. Özellikle, birincil hücre tiplerinin karmaşık kültür koşulları ve düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle yönetmek için zor olabilir. Lonza Nucleofector cihazı gibi teknolojileri kullanımı hücrelerin hızlı bir şekilde işleme yanı sıra önemli ölçüde artmıştır transfeksiyon verimliliği izin verebilirsiniz. Ayrıca, elektroporasyon yöntemleri takip füzyon adımları askıya hücre kolay transferi için izin verir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Worcester Politeknik Enstitüsü Bölümü Kimya ve Biyokimya finansman için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene reagent | Qiagen | 301425 | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | ||
| Trypsin | Fisher | SH3023602 | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher | SH30243FS | High glucose | |
| paraformaldehyde | FisherChemical | O4042-500 | ||
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | ||
| Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Scientific | SH3008803HI | ||
| Falcon 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | ||
| Polyethylene glycol 1000 | Fisher | 528875-25GM | ||
| Cover slips | Fisher | 12-545-85 | ||
| DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | ||
| Nucleofector HDF kit | Lonza | VPD-1001 |
References
- Belaya, K. FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins. RNA. 12, 921-930 (2006).
- Bhaumik, S. R. In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev. 18, 333-343 (2004).
- Cohen, H. R., Panning, B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1. Chromosoma. 116, 373-383 (2007).
- Gao, X. Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).
- Grespin, M. E. Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway. J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).
- Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).
- Jeffries, S., Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).
- Keaton, M. A. Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).
- Ling, P. D. Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function. J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).
- Lin, X. -. F. RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells. J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).
- Vissinga, C. S. Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation. Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).
- Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus. J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).
