异核技术的细胞类型特异性定位分析

1。转染细胞系转染法1 （龙沙Nucleofection为增加原代细胞的转染效率） 细胞应该是最近通过的，并在转染前数期增长。洗净phophate细胞缓冲液（PBS）和收获细胞由胰蛋白酶。 在1500 XG 5分钟，离心收集细胞。 添加消毒盖玻片的6孔​​板。盖玻片，可增强细胞粘附涂层。广场1.5毫升培养基（在这种情况下贝科的改良Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS），）每孔和平衡在孵化器的媒体。 收获细胞胰蛋白酶和悬浮在最小的体积的磷酸盐缓冲液（PBS）。 计数细胞，离心再悬浮的正确金额，提供 5％〜5X10样品细胞。 仔细的细胞重悬于100μL室温每个样品Nucleofector解决方案。 联合收割机100μL的细胞悬液与5μg质粒DNA和样品转移到Nucleofector试管，小心不要包括气泡。 选择适当Nucleofector的程序（这可能需要以前的测试，以确定最佳的转染效率与死亡率最低）。 Nucleofector试管架含有悬浮细胞/ DNA插入试管，并开始选择的程序。 完成后，取出试管，并添加〜500μL预平衡文化传媒（6孔板）。 立即转移到6孔板终体积为1.5毫升，每孔样品。细胞应该是镀在任一混合种群或单独控制。 转染法2 （Qiagen公司Effectene转染细胞系） 准备使用Qiagen公司Effectene试剂的转染复合物，由先加入每个质粒DNA样本的0.8微克至200μL欧共体缓冲区。 每个样品中加入6.4μL，增强试剂，混合短暂弹管，为2分钟，在室温下孵育。 每个样品中，混合加入20μLEffectene试剂弹管，15分钟在室温下孵育。 在此孵化，准备转染细胞系的利益。最近传代细胞（<80％汇合）洗一次在磷酸盐缓冲液（PBS）。在这种情况下加回1.5毫升新鲜的温暖和平衡增长中期（贝科改良Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS））。 一旦转染复合物孵育15分钟，1.2毫升的媒体转移到每个样品。混合吹打，并立即传送〜700μL的配合，在6孔板每两个水井。加入滴加，旋流板，轻轻混匀。允许细胞转染至少3个小时（可能会随细胞类型）来完成。 消毒盖玻片添加到一个新的6孔板。盖玻片，可增强细胞粘附涂层。 转染细胞后，洗细胞两次，用PBS和收获最小的trysinization细胞，每孔加入约100μL胰蛋白酶溶液，简要搅拌充分大衣每口井的板，并立即吸胰蛋白酶。一旦细胞已经解除，加1.5毫升的新鲜传媒。 此时，细胞混合或单独到无菌盖玻片的人口（控制）应镀。 让细胞恢复了12个小时。 2。细胞融合删除从细胞的培养基，用PBS洗两次。 在这一点上，它是建议治疗与放线菌酮（100微克/毫升）的细胞，抑制蛋白质的合成。允许细胞孵育2小时，然后用PBS洗涤细胞两次。 保险丝细胞暴露在室温为125秒，50％聚乙二醇1000（PEG 1000），在无血清DMEM溶液。 用PBS清洗细胞，以消除聚乙二醇1000解决方案，并加入2 ml新鲜温暖和平衡的媒体。 允许细胞孵育18 – 24小时。 荧光显微镜取出培养基，并在PBS洗细胞两次。 加入1毫升4％多聚甲醛溶液（PBS）的每口井，修复细胞。轻轻搅拌15分钟。 在PBS洗两次固定细胞。 小心地从板盖玻片，灯芯多余的PBS。反转到显微镜玻片上装有安装介质的下降（90％甘油，100MM的Tris pH值7.5，2％的DABCO（1,4 – diazabicoyclo辛烷值）含有的DAPI（4',6 – diamidino – 2 -苯基吲哚）。 从幻灯片中删除多余的安装介质，密封合作VER单用指甲油。 通过共聚焦或epifluorescence显微镜可视化的细胞。 3。代表性的成果图2显示了一个例子异核实验，使用的主要的成纤维细胞和H1299非小细胞肺癌细胞。在这个实验的兴趣蛋白（鸡贫血病毒VP3）epifluorescence显微镜观察显示本地化主要是细胞质的主要细胞类型，并在转化细胞类型的核本地化。作为一个融合（无论是绿色荧光蛋白的pEGFP – N1载体，Clontech公司）在主包皮成纤维细胞（PFF）或DsRed的H1299细胞（DsRed的N1载体，Clontech公司）的蛋白表达。控制样品涉及自我融合（前两行）显示多核细胞，在稳定状态下的本土化模式没有改变。这种变化，否则可能出现由于融合条件或syncitia形成的敏感性。异核体的融合（下排）证明GFP融合的主要细胞衍生的蛋白质和引进转化的细胞材料DsRed的融合蛋白的共定位核项目。显示的例子是一种比较罕见的只有两个单元，每个类型之一存在两个氟蛋白信号表明，异核体融合。除了检测本地化转换这些类型，核质穿梭活动，可以很容易被发现在两个细胞核的单荧光团的存在。这种类型的决心是明确的审查1:1细胞融合时，将取决于抑制翻译。 图1。流程图异核体使用主成纤维细胞和非小细胞肺癌细胞H1299的方法 。感兴趣的基因被克隆产生帧融合两个荧光蛋白基因之一。要么构造，然后瞬时转染细胞系，并允许恢复。异核体的形成是诱发进一步孵化与聚乙二醇（PEG）进行了简短的治疗。最后，感兴趣的蛋白质的亚细胞定位是使用各种形式的荧光显微镜观察。 图2。胞核贩运和鸡贫血病毒VP3蛋白的穿梭活动可视化的异核体的融合。首行：代表的图像，中间一排的自我融合H1299细胞表达DsRed的- VP3：小学包皮成纤维细胞的PEG融合后表达GFP – VP3（PFF）代表epifluorescence 图像底部行 ：PFF和H1299细胞的异核体的融合。黄色表示的绿色荧光蛋白DsRed的信号的共定位。细胞成像使用徕卡AF6000E荧光显微镜和Leica成像软件。