Протокол описано, что использует аноксии / голодание в С. Элеганс по моделированию ишемии / реперфузии. Функциональные результаты включают повышенную смертность, видимые отклонения в GFP-меченых нейронов процессов, и нарушение поведенческих реакций, которые требуют функции нейронов.
Протоколы для аноксии / голода в генетическая модель организма C. Элеганс имитировать ишемии / реперфузии. Черви отделены от бактериальной пищи и помещен под аноксии в течение 20 часов (имитация ишемия), а затем переехал в нормальной атмосфере с пищей (имитация реперфузии). Это экспериментальные результаты парадигма в повышенной смертности и повреждения нейронов и методов представлены для оценки жизнеспособности организма, изменения в морфологии сенсорный нейрон процессов, а также чувствительность клавиатуры, который представляет собой поведенческий выход функции нейронов. Наконец, метод построения гипоксические инкубаторы использовании контейнеров общая кухня хранения описывается. Добавление блока управления массового расхода позволяет изменения должны быть внесены в газовой смеси в пользовательских инкубаторов, и ванна с циркулирующей водой позволяет как контроль температуры и позволяет легко определить утечки. Этот метод обеспечивает недорогую альтернативу коммерческиединиц измерения.
С. Элеганс является нематода, которая была широко принята в качестве многоклеточного эукариотической модельного организма с момента ее введения по Бреннер 1. Это дешевый, простой и универсальной моделью, которая позволяет легко связи между генетическими изменениями и фенотипических изменений 2.
Ишемия характеризуется отсутствием питательных веществ и подачи кислорода к ткани, с последующей реперфузией, когда взрыв активных форм кислорода производится 3 и в большинстве случаев ущерб. В 2002 году модель ишемии / реперфузии (ИК) в С. Элеганс был разработан 4 с участием представления весь червя аноксии, питательной лишений и теплового стресса в течение примерно 20 часов с последующим 24 часов при нормальных условиях. Хотя эта модель технически гипоксия-голодание (АС) состояние, гибель клеток происходит с помощью механизмов, которые сохраняются у млекопитающих, в том числе повреждений, вызванных окислителями при реперфузии <SUP> 5. Кроме того, похоже на ИК млекопитающих, повреждение индуцируется как в C. Элеганс можно предотвратить путем предварительной ишемической 6,7 или анестезирующего предварительной 8,9.
Приведенные ниже протоколы показывают, как имитировать ИК в С. Элеганс с использованием модели AS, как забить морфологические и поведенческие отклонения, возникающие в результате AS, и как адаптировать протокол таким образом, что позволяет эксперимент будет проводиться с меньшей первоначальных инвестиций, используя изготовленный на заказ, легко-построенную камеру альтернативу .
Как уже широко используется в С. Элеганс по моделированию ИК травмы. Некоторые ключевые моменты должны быть выделены для этого протокола: C. Элеганс устойчивы к широкому кругу травм, обосновывая необходимость 3 сопутствующих оскорблений (тепло, голодном и гипоксия) для достижения смерть с помощью этой системы. Одна Аноксия не убивает червей в этом окне времени 14. Кроме того, повышение температуры дополнительный стресс, поэтому важно внимательно следить. Строго говоря, голод не вносит значительного вклада со степенью смертности наблюдается 7, по существу, но это, кажется, уменьшает изменчивость среди экспериментальных повторах. Учитывая, что не может быть значительные колебания от изо дня в день, крайне важно, чтобы сравнить образцы запускаются прямо параллельно, и повторить эксперименты на нескольких дней. В общем, результаты измеряются в течение трех отдельных пластин 50-100 червей / экспериментальных условиях, и онин среднем и считается одной экспериментальной репликации. Как правило, от семи до девяти повторов, как представляется, достаточно для достижения или исключить статистической значимости.
Стадия развития червей, используемых в эксперименте также должна быть тщательно проверены как восприимчивости разных этапах как повреждения значительно 15,16 меняется. Использование молодых людей является стандартным, и личиночной стадии (L3 и L4) червей, кажется, более устойчивы к разрушающему воздействию AS (неопубликованные данные).
Этот протокол представляет два пути для выполнения экспериментов, один с помощью лабораторного производства аппарата (используя Tupperware типа контейнеров и подачу газа 11) и другие, используя коммерческий гипоксического камеру 4,6. Anoxia может быть достигнуто с помощью других средств, которые потребляют кислород, как описано в другом месте 13,17. Использование альтернативных методов для создания гипоксических окружающей среды может изменить как инкубация время, необходимоечтобы создать нужное количество смерти. Ориентация ~ 20% выживаемости является идеальной отправной точкой для изучения защитных мер, в то время как 80% является так же идеально подходит для мероприятий, которые усугубляют негативные последствия AS. Еще один важный нюанс является время, в которое набирает наблюдателей мертвые / жив черви. Если время для анализа расширяется за пределы 24 часов, данные могут вводить в заблуждение, так как мертвые черви становятся все более трудно определить. Это может быть связано с червь туши становится относительно прозрачной в течение долгого времени, но и с тем, что оплодотворенные эмбрионы могут перерасти в потомства вскрытии внутри туши и нарушить их по мере их появления.
Анализ морфологии нейронов могут быть изменены, чтобы посмотреть на паттернов экспрессии белка 18, ядерной фрагментации 4 и других параметров 19, заменяя червь штамма, который экспрессирует соответствующий генетически закодированного маркер. И последнее предостережение, что визуализациянейронные процессы должно быть сделано не более 30 мин после размещения червей на слайде. Животных, содержащихся под наркозом на слайдах для более длительные сроки могут проявлять AS-независимый ущерб. Отрегулируйте количество животных на слайд в зависимости от времени, необходимого для отслеживания и анализа их.
The authors have nothing to disclose.
Рисунки 1 и 2 были ранее опубликованы в Free Radical Biology & Medicine (Queliconi соавт. 5) и имеют Авторское право принадлежит Elsevier. Эта работа была поддержана Fundação де Ампаро à Pesquisa сделать Estado де Сан-Паулу (FAPESP), Национальным институтом Ciencia электронной Tecnologia де Processos Редокс ет Biomedicina, в Nucleo де Apoio à Pesquisa де Processos Редокс эм Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) и USPHS GM087483 (KN ). Барбекю является докторант поддерживается общение FAPESP.
N2 strain | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | Wild type strain | |
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons |
CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive |
Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3) | ||
Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |