Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em> C. elegans</em

1. C elegans Wachstum Bereiten 35 mm Nematode Growth Medien (NGM)-Agar-Platten mit OP50 Bakterien geimpft, nach Norm Anbaumethoden ein. Synchronisieren von C. elegans, indem 6 schwangeren Erwachsenen auf eine Platte ausgesät NGM. Entfernen Sie die Erwachsenen nach ~ 100 Eier gelegt (~ 3 h). Die Inkubation für 3 Tage bei 20 ° C, an welchem ​​Punkt die Würmer zu jungen erwachsenen Stadium entwickelt und sind optimal für dieses Experiment. Alternative Protokolle C. synchronisieren elegans sind an anderer Stelle 10 beschrieben. 2. Materialien für AS M9-Puffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) sollte von Sauerstoff durch Äquilibrieren mit N 2 gespült werden vor dem Experiment (Argon können ebenfalls verwendet werden) während 30 min gehalten und umgeben von Eis. Machen Sie ein kleines Loch (3 mmbreit) in dem Deckel von 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, in dem die Würmer während AS gelegt werden. Das Loch für den Gasaustausch ermöglicht, ohne den Deckel offen halten, da dies zu übermäßiger Verdunstung Medien führen. 3. Anoxia / Starvation Führen Sie alle Experimente mindestens in dreifacher Ausfertigung. 1 ml der RT, sauerstoff M9-Puffer zu jedem 35 mm-Platte mit jungen erwachsenen Würmer gewachsen wie oben beschrieben. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, Entfernung von Bakterien von der Platte (Add M9 an den Rändern, wo Bakterien wurden nicht geimpft). Nach ca. 1 min sollte die Würmer schwimmen in der M9. Mantel einer 1 ml Pipettenspitze mit BSA durch Pipettieren und Ausstoßen eines sterilen 1% BSA-Lösung. Die Platte mit den Würmern in M9-Puffer vorsichtig neigen, entfernen Sie die M9 aus dem gleichen Ort, wo es aufgenommen wurde, und legen Sie die Suspension in die vorbereiteten Mikrozentrifugenröhrchen. Ruhen lassen, auf Eis bis die Würmer zu der Unterseite der Rohre fallen gelassen (~ 1-2 Min). Entfernen Sie die maximale Höhe der M9 möglich, ohne die Würmer aus der Röhre zu stören (Abfahrt ca. 100 ul), 1 ml des Sauerstoff gespült und vereist M9 und das Reagenzglas auf Eis, bis die Würmer wieder setzen sich am Boden. Wiederholen Sie den letzten Schritt 3x. In der letzten Waschung, entfernen Sie die M9 bis ~ 100 ul in der Röhre bleibt. Die Röhrchen mit den Würmern in sauerstoffarmes M9 innerhalb einer anoxischen / hypoxischen Kammer (siehe Anleitung unten, Abschnitt 3.6.1) oder alternativ in einem benutzerdefinierten verschlossenen Behälter (siehe unten Anleitungen, Abschnitt 3.6.2). Wenn ein Handels anoxischen / hypoxischen Kammer verwendet werden soll, verlassen einige gespült M9 in der Kammer, bevor Schritt 3.5 und 3.5 wiederholen Schritt, wenn die Würmer sind in der Kammer. Wenn eine benutzerdefinierte Kammer verwendet werden soll, ist eine detaillierte Beschreibung, wie man eine Low-Cost-Gerät zu erstellen am Ende dieses Protokolls vorgestellt und wurde von einer anderen Gruppe zuvor 11 beschrieben. Kurz: <ol> Machen Sie zwei Löcher in einem 250 ml Tupperware-Typ Behälterdeckel und fügen Rohrverbinder zu ihnen. Einer wird verwendet, um das Gasgemisch zu injizieren, während die andere wird der Gasaustritt in ein Wasserbad sein. Zeigen die Würmer in die Kammer und Abdichten der Kammer mit dem Deckel. Gas mit konstantem N 2 Fluss (100 ml / min). Stellen Sie den Behälter in einem Wasserbad bei 26 ° C Sicherzustellen, dass das Ausgangsrohr ist in Wasser eingetaucht, so dass keine Luft zurückkehrt und dass keine Lecks in dem System (scheinbare durch Blasen aus der Kammer selbst). Die Würmer Inkubieren bei 26 ° C für 20 Stunden. 4. Simulierte Reperfusion Nach 20 Stunden unter AS Bedingungen in der Raumluft entfernen Sie die Rohre aus dem Brutraum. Pipette C. elegans mit einer BSA-beschichtete Spitze (wie in Schritt 3.3) auf ein OP50 ausgesät 35 mm NGM Platte. Die Inkubation bei 20 ° C für 24 Stunden.Danach werden die Würmer bereit, erzielt werden kann. 5. Identifizieren Toten Versus Live-Worms Mit einem Platin-Pick, leicht berühren, die oben auf dem Kopf des Wurms. Live-Würmer werden nach berührt rückwärts bewegen. Wenn die Würmer nicht reagierender, zu zählen, wie tot ist. Gelegentlich wird ein Wurm nicht rückwärts bewegen, aber eine leichte Seite-an-Seite Kopfbewegung zu zeigen. Obwohl technisch nicht tot ist, sind diese Würmer fast sicher, innerhalb von Stunden ablaufen und sollte als tot gewertet. Wenn man zu lange, um die Würmer Tor wartet, können interne Schlüpfen der Nachkommen auftreten und diese "Taschen-of-Würmer" reißen können, was Erfassung der Tierkörper sehr schwierig. Entfernen Sie die beiden lebenden und toten Würmer von der Platte, wie sie gezählt werden, um doppelte Zählungen zu vermeiden. Die Live-Würmer können auf einer separaten Platte bewegt, um Verhaltenstests durchzuführen. Die Menge an lebenden Würmer bezogen auf das Gesamt als% der überlebenden Schnecken dargestellt (Figur 1A </strong>). 6. Touch Response Assay Eine ausführliche Beschreibung dieses Protokolls ist in Hart, Anne C., Hrsg. vorgestellt. Verhalten (3. Juli 2006), WormBook, hrsg. Die C. elegans Forschungsgemeinschaft, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. Um Touch-Reaktion zählen, identifizieren Würmer, die sich bewegen und berühren Sie leicht die Seite der Kopf des Wurms (in der Nähe des mittleren Teil des Rachens) mit einem Wimpern Pick (Abbildung 3). Wenn der Wurm sich rückwärts bewegt, Partitur so reagieren, wenn nicht, schieße so nonresponsive (Abbildung 1B). Wiederholen Sie diesen Schritt 10-15x für jeden Wurm mit 10 Sekunden-Intervallen. Sonde mindestens 10 Würmer in jeder Gruppe, um genaue Daten haben. Der gleiche Test kann verwendet folgende leichte Berührung mit der hinteren Körperwand nach vorne zu beurteilen Bewegungs Veränderungen werden. Achten Sie darauf, den Kopf oder Schwanz der Wurm nicht zu berühren, da dies einen deutlichen Verhalten stimuliert. Schließlich wird inUnternehmens genetische Kontrollstämme [N2 Bristol-Wildtyp-positiv, mec (mechanosensorischen) für negative Mutante – zB CB1338 mec-3 (e1338) IV], um die Kraft, mit der die Würmer berühren kalibrieren. Zu hart eines Stimulations eine Verhaltensreaktion in mec Mutanten zu entlocken, zu wenig wird eine Wirkung in Wildtyp N2 Kontrollen nicht zu entlocken. 7. Neuronale Änderungen Um nach AS neuronalen Veränderungen sichtbar zu machen, verwenden Sie einen Stamm, der GFP in den Touch-Neuronen reagieren mec 4,5 ausdrückt. Diese Neuronen haben lange Prozesse, die an der Körperwand laufen und sind leicht für morphologische Auffälligkeiten erzielt. Darüber hinaus kann die morphologische Information mit Verhaltensmaßnahmen der neuronalen Funktion integriert werden, wie oben beschrieben. Ein Stamm, der für diesen Zweck verwendet werden kann, ist TU2583, die erhältlich ist von der C elegans Genetics Center und enthält die uIs25 integrierte Transgen exprimieren GFP herm die mec-18-Promotor, oder alternativ TU2562, die eine integrierte mec-3 :: GFP-Fusions enthält. Bereiten Sie eine Agarose-Pad. Melt 2% Agarose in Wasser, bringen M9 mit einem 10fach-1x und Wartung der Lösung bei 70 ° C Einen Tropfen (~ 20 &mgr; l) dieser Lösung auf einen Objektträger (25 mm x 75 mm), die zwischen zwei anderen Folien, von denen jede ein einziges Stück Klebeband auf ihrer Unterseite platziert ist. Legen Sie eine abschließende Glasobjektträger senkrecht zu der ersten auf dem 2% igen Lösung, und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen. Dies sollte eine Unterlage, die die Dicke des Bandes zu bilden. Entfernen Sie die obere Folie und fügen Sie 10 ul der M9 mit 0,1% Tetramisol, die die Würmer zu immobilisieren wird. Bewegen Sie einige (~ 10) leben Würmer auf den 2% igen Rutsche. Legen Sie ein Deckglas über sie und visualisieren GFP mit einem Fluoreszenzmikroskop unter einem 100X Ziel mit der entsprechenden Beleuchtung. BeschädigtNeuronen eine cytosolische Membranperlenmuster in den Prozessen von mehreren punctum (2A) besteht, und / oder Anomalien, wo die Prozesse scheinen gebrochen zu werden (2B) zu zeigen. Zählen Punctum und Anomalien in beiden Neuronen für jede Schnecke, unter Verwendung von insgesamt mindestens 10 Würmer. 8. Lab hergestellt Hypoxic Kammer Eine Tupperware-Stil, siegelfähige, luftdichten Behälter kann als anoxischen Kammer nachgerüstet werden. Achten Sie darauf, einen Behälter, der so klein wie möglich ist, zu wählen. Ein kleiner Behälter erzeugt eine hypoxische Umgebung schneller und einfacher ist, im Wasserbad (Abbildung 4) passen. Machen Sie zwei Löcher auf dem Deckel (kann mit einem Schraubendreher oder durch Erhitzen Pinzette und zwingt in den Deckel gemacht werden) und legen Sie eine Kunststoff-oder Metallstecker, die den Schlauch (5A) passt. Benutzen Sie Klebstoff, die unter Wasser gesetzt werden kann, und wird hart nach dem Trocknen zu vermeiden Bewegung auchder Stecker und damit die Möglichkeit einer Leckage (Fig. 5B) verringert wird. Der Behälter sollte in das Wasserbad gestellt werden, so dass sie vollständig (Fig. 4) eingetaucht. Um den Behälter eintauchen, mit einem Flaschengewicht oder ein Tauchgewicht. Einer der Rohrverbindungen werden verwendet, um eine Gasmischung einzuführen und die andere Röhre wird als Überdruck wirken, daher sollte es unter Wasser gelassen, so dass der Behälter von der äußeren Umgebung (4) abgedichtet werden. Die Luftzusammensetzung kann durch maßgeschneiderte Gas, Massendurchflussregler oder ein Gerät, das die gewünschten Gase mischt moduliert werden. Der Gasfluss sollte kontrolliert werden, da hohe Strömungs können übermäßige Verdunstung erstellen. Beispielsweise in einem 250 ml-Behälter mit 100 ml / min Gas gute Raum für die Würmer und einen geeigneten Fluß bereitzustellen. Die Länge der Rohrleitung auf einem Minimum gehalten werden, da sie durchlässig für Gas, eine sein kann,llowing der Eingang von O 2. Es ist wichtig, zu vermeiden, mit Silikon, Tygon-Röhren als diese Materialien sind durchlässig für den Gasaustausch. Wir bevorzugen Polypropylen oder Nylon Rohre. Glas-oder Metallrohre halten die Gase gut, sind aber auch schwieriger zu verarbeiten.