Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em> C. elegans</em

1. C. elegans Groei Bereid 35 mm Nematoden Groei Media (NGM) agar platen geënt met OP50 bacteriën, volgens de standaard teeltmethoden 1. Synchroniseer C. elegans door het plaatsen van 6 zwangere volwassenen op een geplaatste NGM plaat. Verwijder volwassenen na ~ 100 eieren gelegd (~ 3 uur). Incubeer de platen gedurende 3 dagen bij 20 ° C, waarna de wormen ontwikkeld jonge volwassen stadium en zijn optimaal voor dit experiment. Alternatieve protocollen C. synchroniseren elegans worden elders 10 beschreven. 2. Materialen voor AS M9 buffer (22 mM KH 2PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4) worden gezuiverd van zuurstof door equilibreren met N2 (argon kan ook worden gebruikt) gedurende 30 min voorafgaand aan het experiment en bleef omringd door ijs. Maak een klein gaatje (3 mmbreed) in het deksel van 1,5 ml microcentrifuge buizen waarin de wormen worden tijdens AS geplaatst. Het gat zorgt voor gasuitwisseling zonder het houden van het deksel open, omdat dit kan leiden tot overmatige media verdamping. 3. Anoxie / Honger Voer alle experimenten ten minste in drievoud. Voeg 1 ml van RT, geoxygeneerde M9 buffer elke 35 mm plaat met jonge volwassen wormen gekweekt zoals hierboven beschreven. Let op dat het verwijderen van bacteriën uit de plaat (voeg M9 aan de randen waar bacteriën niet werden uitgezet). Na ~ 1 min de wormen moeten zwemmen in de M9. Coat een 1 ml pipet tip met BSA door pipetteren en het verdrijven van een steriele 1% BSA-oplossing. Neig de plaat zorgvuldig met de wormen in M9 buffer, verwijder de M9 uit dezelfde plaats waar het werd toegevoegd, en plaats de suspensie in de voorbereide microcentrifugebuizen. Laat rusten in ijs tot de wormen zijn gedaald tot beneden de buizen (1 ~-2 Min). Haal het maximale bedrag van de M9 mogelijk zonder de wormen te verstoren van de buis (het verlaten van ongeveer 100 pl), voeg 1 ml van de zuurstof gespoeld en iced M9 en plaats de buis over ijs tot de wormen naar de bodem weer. Herhaal de laatste stap 3x. In de laatste wasbeurt, verwijder dan de M9 tot ~ 100 pi blijft in de buis. Plaats de buizen met de wormen in zuurstofarme M9 in een zuurstofloze / zuurstofarme kamer (zie aanwijzingen hieronder, paragraaf 3.6.1) of, als alternatief, in een aangepaste gesloten verpakking (zie onderstaande instructies, paragraaf 3.6.2). Als een commerciële zuurstofloze / zuurstofarme kamer wordt gebruikt, laat wat gespoeld M9 in de kamer voordat stap 3.5 en herhaal stap 3.5 zodra de wormen zijn in de kamer. Als een aangepaste kamer wordt gebruikt, wordt een gedetailleerde beschrijving van hoe een goedkope inrichting te creëren die eind van dit protocol is beschreven door een andere groep vooraf 11. In het kort: <ol> Maak twee gaten in een 250 ml Tupperware-achtige deksel en voeg buisconnectoren aan hen. Men zal worden gebruikt om het gasmengsel injecteren terwijl de andere het uitlaatgas in een waterbad wordt. Plaats de wormen in de kamer en sluit de kamer met behulp van de deksel. Gas met een constante N2 stroom (100 ml / min). Plaats de container in een waterbad bij 26 ° C. Zorg ervoor dat de uitgang buis goed is ondergedompeld in water, zodat er geen lucht terugkeert en dat er geen lekken in het systeem (schijnbare door bellen die voortvloeien uit de kamer zelf). Incubeer de wormen bij 26 ° C gedurende 20 uur. 4. Gesimuleerde Reperfusie Na 20 uur onder AS voorwaarden, verwijder de buizen uit de incubatiekamer in omgevingslucht. Pipet C. elegans met een BSA-gecoate tip (zoals in stap 3.3) op een OP50 gezaaid 35 mm NGM plaat. Incubeer de platen bij 20 ° C gedurende 24 uur.Hierna zal de wormen klaar gescoord worden. 5. Het identificeren van Dead Versus levende wormen Met behulp van een platina pick Druk licht op de bovenkant van het hoofd van de worm. Levende wormen zal achteruit na aangeraakt te verplaatsen. Als de wormen zijn niet meer reageert, scoren als dood. Af en toe zal een worm niet achteruit te gaan, maar kan een kleine side-to-side beweging van het hoofd vertonen. Hoewel het technisch niet dood, deze wormen zijn bijna zeker te vervallen binnen enkele uren, en moet worden als dood. Als men te lang om te scoren de wormen wacht, kan de interne uitkomen van nageslacht optreden en deze "zakken-of-wormen" kunnen scheuren, waardoor het opsporen van de karkassen erg moeilijk. Verwijder beide levende en dode wormen van de plaat zoals ze worden geteld om dubbele tellingen te vermijden. De levende wormen kunnen worden verplaatst naar een afzonderlijke plaat gedrag assays. De hoeveelheid levende wormen vergeleken met het totaal wordt weergegeven als% overlevende wormen (Figuur 1A </strong>). 6. Touch Response Assay Een gedetailleerde beschrijving van dit protocol is gepresenteerd in Hart, Anne C., ed.. Gedrag (3 juli 2006), WormBook, ed.. De C. elegans Research Gemeenschap, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. Te scoren voor touch reactie, identificeren wormen die bewegen en licht raken de zijkant van het hoofd van de worm (in de buurt van het middelste deel van de keelholte) met een wimper pick (Figuur 3). Als de worm schuift naar achteren, scoren zo reageren, zo niet, scoor reageert niet (Figuur 1B). Herhaal deze stap 10-15x voor elke worm met 10 sec interval. Probe tenminste 10 wormen in elke groep om nauwkeurige gegevens. Dezelfde test kan worden gebruikt om vooruit te beoordelen motorische veranderingen na lichte aanraking met het achterste lichaam muur. Zorg ervoor dat de kop of staart van de worm niet aan te raken, want dit bevordert een duidelijke gedrag. Ten slottecollectieve genetische controle stammen [N2 Bristol wild-type voor positieve, mec (mechanosensorische) mutant voor negatieve – bijvoorbeeld CB1338 mec-3 (e1338) IV] om de kracht waarmee de wormen raken kalibreren. Te hard van een stimulatie zal een gedragsmatige respons op te wekken in mec mutanten, te weinig zal een effect niet ontlokken in wildkleur N2 controles. 7. Neuronale Wijzigingen Te visualiseren bericht AS neuronale wijzigingen, gebruik dan een stam die GFP uitdrukt in het touch-reagerende mec neuronen 4,5. Deze neuronen lange uitlopers die langs de lichaamswand en worden gemakkelijk behaald morfologische afwijkingen. Daarnaast kan de morfologische informatie geïntegreerd gedragsmetingen neuronale functie, zoals hierboven beschreven. Een stam die kan worden gebruikt voor dit doel TU2583, die verkrijgbaar is uit de C. elegans Genetica Center en bevat de uIs25 geïntegreerde transgen GFP weerm de mec-18 promotor, of alternatief TU2562, waarin een geïntegreerde mec-3 :: GFP-fusie bevat. Bereid een agarose pad. Smelt 2% agarose in water, breng aan M9 1x met een 10x voorraad, en de oplossing te handhaven op 70 ° C. Breng een druppel (~ 20 pi) van deze oplossing op een glasplaatje (25 mm x 75 mm) die is geplaatst tussen twee dia's, die elk een stuk tape op de onderzijde. Plaats een definitieve glasplaatje loodrecht op de eerste bovenop de 2% agarose oplossing en laat het afkoelen bij kamertemperatuur. Dit zou een pad dat de dikte van de band vormen. Verwijder de bovenste dia en voeg 10 ul van M9 die 0,1% tetramisol, die de wormen zal immobiliseren. Verplaats enkele (~ 10) leven wormen op de 2% agarose glijbaan. Plaats een dekglaasje over hen en visualiseren GFP met behulp van een fluorescentie microscoop onder een 100x objectief met de juiste belichting. Beschadigdeneuronen een cytosolische membraan parelsnoer patroon in de processen uit meerdere punctum (figuur 2A) en / of afwijkingen waarin zich lijkt te breken (figuur 2B) tonen. Telling punctum en vertonen in zowel neuronen per worm, met in totaal ten minste 10 wormen. 8. -Lab gemaakt Hypoxic Kamer Een Tupperware-stijl, afsluitbaar, luchtdichte container kan worden uitgerust als een zuurstofloze kamer. Zorg een container die zo klein mogelijk te kiezen. Een kleine container creëert een hypoxische omgeving sneller en gemakkelijker te passen in het waterbad (figuur 4). Maak twee gaten in het deksel (kan worden gedaan met een schroevendraaier of door verhitting pincet en dwingen in het deksel) en plaats een plastic of metalen connector die de buis (figuur 5A) past. Gebruik lijm die onder water kan worden gebracht en ook wordt hard na drogen verplaatsing voorkomende connector en daarmee de kans op lekken (Figuur 5B) verminderen. De houder moet in het waterbad worden geplaatst dat het volledig is ondergedompeld (figuur 4). Om de container te dompelen, gebruik dan een fles gewicht of een snoekduik gewicht. Een pijpverbindingen worden gebruikt om een gasmengsel te voeren en de andere buis fungeert als een drukontlasting, daarom moet het onder water gelaten zodat de houder is afgesloten van de externe omgeving (figuur 4). De samenstelling van de lucht kan worden gemoduleerd met behulp van aangepaste gemaakt gas, mass flow controllers of een apparaat dat de gewenste gassen mengt. De gasstroom moet worden gecontroleerd, zoals high flow overmatige verdamping kan creëren. Bijvoorbeeld, in een 250 ml beker, 100 ml / min van gas goede ruimte voor de wormen en een geschikte flux verschaffen. De lengte van de buis moet tot een minimum worden beperkt, aangezien zij gasdoorlatend, kan eenllowing de ingang van O 2. Het is belangrijk om te voorkomen dat het gebruik van siliconen, Tygon buizen omdat deze materialen zijn doorlaatbaar voor gasuitwisseling. Wij verkiezen polypropyleen of nylon buizen. Glazen of metalen buis handhaven van de gassen goed, maar zijn ook moeilijker om mee te werken.