يوصف بروتوكول يستخدم نقص الأكسجين / المجاعة في C. ايليجانس لنموذج نقص التروية / ضخه. وتشمل النتائج الفنية زيادة معدل الوفيات، تشوهات واضحة في العمليات العصبية GFP المسمى، وضعف الاستجابات السلوكية التي تتطلب وظيفة الخلايا العصبية.
بروتوكولات لنقص الأكسجين / المجاعة في الجينية النموذج الحي C. ايليجانس محاكاة نقص التروية / ضخه. يتم فصل الديدان من المواد الغذائية البكتيرية وضعت تحت نقص الأكسجين لمدة 20 ساعة (نقص التروية محاكاة)، وبعد ذلك انتقلت إلى أجواء طبيعية مع الغذاء (ضخه محاكاة). يتم عرض هذه النتائج النموذج التجريبي في زيادة الوفيات والأضرار العصبية، وتقنيات لتقييم الجدوى الحي، تعديلات على التشكل من العمليات العصبية التي تعمل باللمس، فضلا عن حساسية اللمس، والذي يمثل الناتج السلوكية وظيفة الخلايا العصبية. أخيرا، وصفت طريقة لبناء حاضنات ميتة باستخدام حاويات تخزين المطبخ المشترك. إضافة وحدة التحكم في التدفق الجماعي يسمح للتعديلات المطلوب ادخالها على خليط الغاز في حاضنات مخصصة، وحمام مائي تعميم يسمح لكلا التحكم في درجة الحرارة ويجعل من السهل التعرف على تسرب. وهذه الطريقة توفر بديلا منخفض التكلفة لأسس تجاريةالوحدات المتاحة.
C. ايليجانس هو الخيطية التي اعتمد على نطاق واسع متعددة الخلايا حقيقية النواة النموذج الحي منذ بدء العمل به من قبل برينر 1. بل هو، نموذج بسيط، وتنوعا رخيصة، والذي يسمح روابط سهلة بين تغيرات جينية والمظهري يتغير 2.
يتميز نقص التروية بسبب نقص المواد الغذائية والأوكسجين إلى الأنسجة، تليها ضخه، وعندما يتم إنتاج وابلا من أنواع الاكسجين التفاعلية (3) ومعظم الضرر يحدث. في عام 2002، وهذا نموذج من نقص التروية / ضخه (IR) في C. وقد وضعت ايليجانس 4 تنطوي على تقديم دودة كاملة لنقص الأكسجين، والحرمان من المواد الغذائية والإجهاد الحراري لحوالي 20 ساعة تليها 24 ساعة في ظل ظروف طبيعية. على الرغم من أن هذا النموذج من الناحية التقنية لنقص الأكسجين المجاعة (AS) حالة، يحدث موت الخلايا من خلال الآليات التي يتم حفظها في الثدييات، بما في ذلك الضرر الناجم عن الأكسدة خلال ضخه <سوب> 5. وعلاوة على ذلك، على غرار الثدييات الأشعة تحت الحمراء، والضرر الناجم عن AS في C. ايليجانس يمكن منعها من خلال شروط مسبقة الدماغية 6،7 أو 8،9 مخدر شروط مسبقة.
شرح بروتوكولات أدناه كيفية تقليد IR في C. ايليجانس باستخدام نموذج AS، وكيفية تسجيل الشذوذات الشكلية والسلوكية التي تنتج عن AS، وكيفية التكيف مع البروتوكول بطريقة تسمح التجربة التي ستجرى مع الاستثمار الأولي أقل باستخدام حسب الطلب، شيدت بسهولة بديلة الغرفة .
AS قد استخدمت على نطاق واسع في C. ايليجانس لنموذج إصابة الأشعة تحت الحمراء. وينبغي إبراز بعض النقاط الرئيسية لهذا البروتوكول: C. ايليجانس هي مقاومة للمجموعة واسعة من الإصابات، التي تبرر الحاجة لمدة 3 الشتائم يصاحب ذلك (الحرارة والجوع ونقص الأكسجين) لتحقيق الموت باستخدام هذا النظام. نقص الأكسجين وحده لا يقتل الديدان في هذا الإطار من الوقت 14. علاوة على ذلك، ارتفاع درجة الحرارة هو الإجهاد إضافية، لذلك من المهم أن ترصد عن كثب. بالمعنى الدقيق للكلمة، لا يسهم المجاعة إلى حد كبير في درجة وفيات وحظ 7، في حد ذاتها، ولكن يبدو للحد من التباين بين مكررات التجريبية. بالنظر إلى أن يمكن أن يكون هناك تباين كبير من يوم إلى يوم، من المهم للغاية لمقارنة عينات تشغيلها مباشرة في موازاة ذلك، وتكرار التجارب على مدى عدة أيام. بشكل عام، يتم قياس النتائج لمدة ثلاث لوحات منفصلة من 50-100 الديدان / حالة تجريبية وهذه هين المتوسط ويعتبر تكرار التجريبية واحد. عموما، تظهر ما بين سبعة وتسعة مكررات أن تكون كافية لتحقيق أو استبعاد دلالة إحصائية.
تحتاج المرحلة التنموية من الديدان التي استخدمت في التجربة أيضا أن يتم رصدها بعناية كما قابلية مراحل مختلفة لAS الضرر يختلف اختلافا كبيرا 15،16. استخدام الشباب هو المعيار، وتظهر مرحلة اليرقات (L3 L4 و) الديدان لتكون أكثر قدرة على مقاومة الآثار الضارة للAS (بيانات غير منشورة).
ويعرض هذا البروتوكول طريقتان لإجراء التجارب، واحد باستخدام جهاز من صنع مختبر (باستخدام تثبرور من نوع الحاويات وإدخال الغاز 11) وغيرها باستخدام غرفة ميتة التجارية 4،6. لا يمكن أن يتحقق بوسائل أخرى نقص الأكسجين التي تستهلك الأوكسجين، كما هو موضح في أماكن أخرى 13،17. استخدام تقنيات بديلة لخلق بيئة ميتة قد تغيير الوقت AS الحضانة اللازمةلإنشاء المبلغ المطلوب من الموت. استهداف بقاء ~ 20٪ هو نقطة انطلاق مثالية لدراسة تدخلات وقائية، في حين أن 80٪ مثالية بالمثل لالتدخلات التي تؤدي إلى تفاقم الآثار الضارة للAS. تحذير هام آخر هو الوقت الذي عشرات القتلى مراقب الديدان / على قيد الحياة. إذا تم تمديد الوقت لتحليل ما وراء مدار 24 ساعة، قد تكون البيانات مضللة منذ الديدان الميتة يصبح من الصعب على نحو متزايد لتحديد. قد يكون هذا بسبب جثث دودة تصبح شفافة نسبيا مع مرور الوقت، ولكن أيضا إلى حقيقة أن الأجنة المخصبة يمكن أن تتطور إلى ذرية بعد الوفاة داخل أطر وتعطيل لهم لأنها تظهر.
يمكن تعديل تحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية للنظر في أنماط التعبير البروتين 18، تجزئة النووية (4) وغيرها من المعالم 19 عن طريق استبدال سلالة دودة التي تعبر عن المناسبة علامة المشفرة وراثيا. واحد التحذير النهائي هو أن التصور للالعمليات العصبية ينبغي القيام به أقل من 30 دقيقة بعد وضع الديدان على الشريحة. أبقى حيوانات تحت التخدير على الشرائح لفترات أطول يمكن أن يحمل الضرر AS-مستقلة. ضبط كمية من الحيوانات لكل شريحة وفقا للوقت اللازم لتتبع وتحليلها.
The authors have nothing to disclose.
الأرقام 1 و 2 ونشرت سابقا في علم الأحياء والطب الراديكالي الحرة (Queliconi وآخرون. 5) ولها حقوق الطبع والنشر التي عقدها إلسفير. وأيد هذا العمل من قبل فندجاو دي أمبارو à Pesquisa تفعل استادو دي ساو باولو (FAPESP) والمعهد الوطني للبحوث والتكنولوجيا Ciência ه دي Processos الأكسدة م Biomedicina، ونكليوتيد دي Apoio à Pesquisa دي Processos الأكسدة م Biomedicina، USPHS NS064945 (KN)، وUSPHS GM087483 (KN ). BBQ هو طالب دكتوراه بدعم من زمالة مؤسسة FAPESP.
N2 strain | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | Wild type strain | |
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons |
CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive |
Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3) | ||
Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |