허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em> C. 엘레</em

1. C. 엘레 성장 표준 재배 방법 1 당 OP50 박테리아와 시드 35mm 선충류 성장 미디어 (NGM) 한천 플레이트, 준비합니다. 시드 NGM 판에 6 임신하는 성인을 배치하여 C. elegans의 동기화. ~ 100 계란 (~ 3의 시간)을 배치 한 후 성인을 제거합니다. 벌레가 젊은 성인 단계로 개발이 실험을 위해 최적화되어있다 할 시점에서 20 ° C에서 3 일, 대한 번호판을 품어. C. 동기화하는 다른 프로토콜 엘레 다른 곳에서 10에 설명되어 있습니다. 2. AS 용 재료 M9 완충액 (22 mM의 KH 2 PO 4, 42 mM의 나 2 HPO 4, 86 mM의 염화나트륨, 1 mM의 MgSO4로)가 N 2로 평형화하여 산소로 퍼징한다 실험 전에 30 분 동안 (아르곤은 또한 사용될 수있다) 얼음에 둘러싸여 있었다. 작은 구멍 (3mm 만들기) 폭은 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 뚜껑에있는 벌레는 AS 동안 배치됩니다. 이 과도한 미디어의 증발로 이어질 수있는 구멍은, 뚜껑을 열어 유지하지 않고 가스를 교환 할 수 있습니다. 3. 산소 결핍 / 기아 적어도 중으로 모든 실험을 실시한다. 상술 한 바와 같이 성장 젊은 성인 벌레를 포함하는 각 35mm 판에 RT 1 ㎖​​, 산소 M9 버퍼를 추가합니다. (박테리아가 접종되지 않은 가장자리에 M9 추가) 판에서 박테리아를 제거하지 않도록주의하십시오. ~ 1 분 후에 벌레는 M9에서 수영을해야합니다. 피펫 및 멸균 1 % BSA 솔루션을 추방하여 코트 BSA와 1 ㎖ 피펫 팁을. 정중 M9 버퍼에 웜을 포함하는 플레이트를 기울여, 그것이 첨가 같은 장소에서 M9을 제거하고, 제조 된 마이크로 원심 튜브에 서스펜션을 배치. 웜은 튜브의 바닥에 떨어졌다 때까지 얼음에 나머지를하자 (1 ~-2 분). (약 100 μl를 떠나) 튜브에서 벌레를 방해하지 않고 가능한 M9의 최대 양을 제거, 산소 제거 및 아이스 M9의 1 ML을 추가하고 벌레가 다시 바닥에 정착 할 때까지 얼음에 튜브를 배치합니다. 마지막 단계의 3 배를 반복합니다. ~ 100 μL는 튜브에 남아 때까지 마지막 세척에서, M9를 제거합니다. (3.6.2 절, 아래의 방법을 참고하십시오) 지정 밀폐 용기에, 또는, (아래의 지시 사항, 3.6.1 절 참조) 또는 무산소 / 저산소 챔버 내부에 환원 된 M9의 벌레와 튜브를 놓습니다. 시판의 무산소 / 저산소 챔버가 사용되는 경우, 단계 3.5를 시작하기 전에, 챔버 내부에 일부 치환 M9를 남기고 웜 챔버 내부 일단 단계 5를 반복한다. 커스텀 챔버가 사용될 경우, 저비용 장치를 생성하는 방법의 상세한 설명은이 프로토콜의 단부에 제공된다 (11)과 이전에 다른 그룹에 의해 설명되었다. 간단히 : <ol> 250 ㎖의 유리 섬유 복합 재질의 타입 용기 뚜껑에 두 개의 구멍을 만들어 그들에게 튜브 커넥터를 추가합니다. 하나는 다른 수조에 가스 출구 것이다 동안 가스 혼합물을 주입하기 위해 사용된다. 챔버에 벌레를 넣고 뚜껑을 사용하여 챔버를 밀봉. 상수 N 2 플럭스 (100 ㎖ / 분)와 가스. 26 ℃의 물을 욕조 안에 컨테이너를 배치 누수가 (실 자체에서 발생하는 기포에 의한 명백한) 시스템에 없는지없이 공기가 반환되도록 출구 관은 물에 잘 포장되어 있는지 확인합니다. 20 시간 동안 26 ° C에서 벌레를 품어. 4. 시뮬레이션 재관류 AS 조건에서 20 시간 후, 실내 공기에 배양 챔버에서 튜브를 제거합니다. 피펫 C. OP50 상 (단계 3.3에서와 같이) BSA 코팅 된 팁 엘레 35mm NGM 플레이트를 시드. 24 시간 동안 20 ° C에서 접시를 품어.이 후, 벌레가 득점 할 준비가 될 것입니다. 5. 라이브 웜 수스가 죽은 확인 백금 픽을 사용하여 가볍게 웜의 머리의 상단을 터치합니다. 라이브 벌레는 터치 후 뒤로 이동합니다. 벌레가 응답하지 않는 경우, 죽은로 점수. 때때로, 웜은 뒤로 이동하지 않지만 약간 옆으로 머리의 움직임을 보일 수 있습니다. 기술적으로 죽은하지 않지만, 이러한 웜은 시간 이내에 만료 거의 확실하고, 죽음으로 채점한다. 하나는 웜 점수를하는 데 시간이 너무 오래 기다리는 경우, 자손의 내부 부화가 발생할 수 있으며, 이러한 "가방 – 중 – 웜은"매우 어려운 시체를 검출하고, 파열 할 수 있습니다. 그들이 중복 계산을 피하기 위해 계산 될 때 플레이트에서 모두 라이브와 죽은 벌레를 제거합니다. 라이브 웜 행동 분석을 수행하기 위해 별도의 플레이트로 이동 될 수있다. 전체를 기준으로 사는 벌레의 양이 남아있는 벌레의 %로 표시됩니다 (그림 1A </st룽>). 6. 응답 분석을 터치 이 프로토콜에 대한 자세한 설명은 하트 앤 C., ED에 제시되어 있습니다. 동작 (2006년 7월 3일), WormBook, 에디션. C. elegans의 연구 커뮤니티, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. 터치 반응에 대한 점수를하기 위해 이동하고 가볍게 속눈썹 선택 (그림 3)과 (인두의 중간 부분 근처) 웜의 머리의 측면을 터치하는 웜을 식별합니다. 웜이 뒤로 이동하는 경우 같은 응답 점수를, 그렇지 않은 경우 (그림 1B)로 응답하지 않는 점수. 10 초 간격으로 각각의 벌레에 대해이 단계 10 – 15 배를 반복합니다. 정확한 데이터를 가지고 각 그룹에서 최소 10 벌레를 조사. 동일한 분석은 후부 체벽에 가볍게 누르고 다음 순방향 locomotory 변화를 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 별개의 행동을 자극하기 때문에 웜의 머리 또는 꼬리에 닿지 않도록해야합니다. 마지막으로,에기업 유전자 제어 계통 [네거티브에 대한 긍정적, 멕 (mechanosensory) 돌연변이에 대한 N2 브리스톨 야생 형 – 예를 들어, CB1338 MEC-3 (e1338) IV] 벌레를 터치로 힘을 보정한다. 자극이 너무 가혹한도 조금 야생형 N2 컨트롤에 효과를 유도하지 않습니다, 멕 돌연변이의 행동 반응을 유도 할 것이다. 7. 신경 수정 의 연결을 수정 AS 포스트를 시각화 터치 응답 멕 신경 4,5에 GFP를 표현하는 변형을 사용합니다. 이 신경 세포는 신체의 벽을 따라 실행하고 쉽게 형태 학적 이상 득점하는 긴 과정이있다. 또, 형태 학적 정보는 전술 한 바와 같이, 신경 기능의 행동 대책과 통합 될 수있다. 이 목적을 위해 사용될 수있는 하나의 균주 C.에서 사용할 TU2583이며 엘레 유전학 센터 이리저리 GFP를 표현 uIs25 통합 형질 전환 유전자를 포함통합 MEC-3 :: GFP 융합을 포함하는 MEC-18 프로모터, 또는 대안 TU2562을 해요. 아가로 오스 패드를 준비합니다. 물에 10 배 주식으로 M9을 배일 가지고, 70 ℃에서 솔루션을 유지 아가로 오스 2 %를 용융 자신의 바닥면에 테이프의 한 조각이 각각 다른 두 슬라이드 사이에 배치 된 유리 슬라이드 (X 75mm 25mm)에이 솔루션의 드롭 (~ 20 μL)을 놓습니다. 2 % 아가로 오스 솔루션의 맨 첫 번째에 수직 최종 유리 슬라이드를 배치하고, 실온에서 냉각 할 수 있습니다. 이는 테이프의 두께 패드를 형성한다. 상단 슬라이드를 제거하고 벌레를 무력화합니다 0.1 % tetramisole를 포함하는 M9의 10 μl를 추가합니다. 2 % 아가로 오스 슬라이드에 벌레를 사는 일부 (~ 10)로 이동합니다. 그들에 커버 슬립을 놓고 적절한 조명과 100X 목적에 따라 형광 현미경을 이용하여 GFP를 시각화. 손상된뉴런은 프로세스 (그림 2B) 깨진 것으로 나타 세포질 막 여러 누점 (그림 2A)로 구성 과정에서 진주 패턴의 문자열, 및 / 또는 이상을 보여줄 것이다. 적어도 10 벌레의 총을 사용하여 각 웜 모두 신경에있는 눈물 점 이상을 계산합니다. 8. 실험실에서 만든 저산소 챔버 유리 섬유 복합 재질의 스타일, 밀봉, 밀폐 용기는 무산소 챔버로 개조 할 수있다. 가능한 한 작은 컨테이너를 선택하는데주의를 기울여야. 작은 컨테이너는 빠른 저산소 환경을 생성하고 (그림 4) 물을 욕조에 맞게하는 것이 더 쉽습니다. 뚜껑에 두 개의 구멍이 (드라이버 또는 집게를 가열하고 뚜껑에 강제로 수행 할 수 있습니다) 확인하고 튜브 (그림 5A)을 맞는 플라스틱 또는 금속 커넥터를 삽입합니다. 물에 배치 할 수있는 접착제를 사용하고, 또한 운동을 피하고, 건조 후 힘들어커넥터 따라서 누설의 가능성 (도 5b)을 감소시킨다. 그것이 (도 4) 완전히 잠기도록 용기는 수조에 배치되어야한다. 용기를 체험하기 위해, 병의 중량 다이빙 무게를 사용합니다. 관 연결 중 하나는 가스 혼합물을 도입하고 다른 튜브 용기가 외부 환경 (도 4)로부터 밀폐 차단되도록 따라서는 물 아래 두어야, 압력 완화 역할을 사용한다. 공기 조성물 주문품 가스 질량 흐름 제어기 또는 원하는 가스 혼합물 어떠한 장치를 사용하여 변조 될 수있다. 높은 유동은 과도한 증발을 만들 수있는 가스 유동이 제어되어야한다. 예를 들어, 250 ml의 용기에 가스를 100 ㎖ / 분 웜 좋은 공간과 적절한 유량을 제공 할 것입니다. 그들은 가스, 투과 될 수있는 튜브의 길이는 최소로 유지되어야llowing O 2의 입구. 이러한 물질이 가스 교환에 투과성으로 실리콘을 사용하지 않도록하는 것이 중요하다, 타이곤은 관. 우리는 폴리 프로필렌 또는 나일론 튜브를 선호합니다. 유리 또는 금속 튜브가 아니라 가스를 유지뿐만 아니라 작업하기 어렵습니다.