Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em> C. elegans</em

1. C. Crecimiento elegans Preparar 35 mm Nematodo Crecimiento Medios (NGM) placas de agar sembradas con bacterias OP50, como por métodos de cultivo estándar 1. Sincronizar C. elegans mediante la colocación de 6 adultos grávidas en una placa de NGM sin ​​semillas. Retire los adultos después de ~ 100 huevos se han establecido (hr ~ 3). Las placas se incuban durante 3 días a 20 º C, momento en el que los gusanos se han desarrollado hasta la etapa adulta joven y son óptimos para este experimento. Protocolos alternativos para sincronizar C. elegans se describen en otra parte 10. 2. Materiales para AS M9 buffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM de Na 2 HPO 4, NaCl 86 mM, 1 mM MgSO 4) debe ser purgada de oxígeno equilibrando con N 2 (argón también se puede utilizar) durante 30 min antes del experimento y se mantiene rodeado de hielo. Haz un pequeño agujero (3 mmde ancho) en la tapa de 1,5 ml tubos de microcentrífuga en el que se colocarán los gusanos durante AS. El agujero permite el intercambio de gases sin tener la tapa abierta, ya que esto puede conducir a un exceso de evaporación medios. 3. Anoxia / Inanición Llevar a cabo todos los experimentos al menos por triplicado. Añadir 1 ml de tampón de RT, M9 oxigenada a cada placa de 35 mm que contiene gusanos adultos jóvenes cultivadas como se describe anteriormente. Tenga cuidado para evitar la eliminación de las bacterias de la placa (añadir M9 a los bordes en los que no se sembraron las bacterias). Después de ~ 1 min los gusanos deben nadando en el M9. Escudo una punta de pipeta de 1 ml con BSA al vaso y la expulsión de una solución estéril de BSA al 1%. Incline con cuidado la placa que contiene los gusanos en tampón M9, retire la M9 desde el mismo lugar en el que se añadió, y colocar la suspensión en los tubos de microcentrífuga preparadas. Dejar reposar en hielo hasta que los gusanos han caído a la parte inferior de los tubos (~ 1-2 Min). Retire la mayor cantidad de M9 posible sin molestar a los gusanos del tubo (dejando unos 100 l), añadir 1 ml de la M9 y helado purgado con oxígeno y colocar el tubo en hielo hasta que los gusanos depositan en el fondo de nuevo. Repita el último paso de 3x. En el último lavado, eliminar la M9 hasta ~ 100 l permanece en el tubo. Coloque los tubos con los gusanos en desoxigenada M9 dentro de una cámara anóxica / hipóxica (ver instrucciones abajo, Sección 3.6.1) o, alternativamente, en un contenedor sellado a medida (vea las instrucciones más adelante, sección 3.6.2). Si un anóxica / hipóxica cámara comercial es para ser utilizado, dejar un poco de M9 purgado dentro de la cámara antes de comenzar el paso 3.5 y repita el paso 3.5 una vez que los gusanos son dentro de la cámara. Si una cámara personalizada se va a utilizar, una descripción detallada de cómo crear un aparato de bajo costo se presenta al final de este protocolo y ha sido descrito por otro grupo previamente 11. En pocas palabras: <ol> Haga dos agujeros en la tapa 250 de tipo Tupperware ml recipiente y agregue conectores de tubos para ellos. Una de ellas será usada para inyectar la mezcla de gas mientras que el otro será el de salida de gas en un baño de agua. Coloque los gusanos en la cámara y sellar la cámara con la tapa. De gas con una constante N 2 de flujo (100 ml / min). Coloque el recipiente en el interior de un baño de agua a 26 ° C. Asegúrese de que el tubo de salida está bien sumergido en agua por lo que no hay retornos de aire y que no hay fugas en el sistema (aparente por las burbujas que surgen de la propia cámara). Incubar los gusanos a 26 ° C durante 20 horas. 4. La reperfusión simulado Después de 20 horas bajo condiciones que, retire los tubos de la cámara de incubación en el aire ambiente. Pipetear C. elegans con una punta recubierta con BSA (como en el paso 3.3) en un OP50 sembró 35 mm placa de NGM. Incubar las placas a 20 ° C durante 24 horas.Después de esto, los gusanos estarán listos para ser anotado. 5. Identificar Dead Versus vivo Worms Usando una selección de platino, toque ligeramente la parte superior de la cabeza del gusano. Gusanos vivos se moverán hacia atrás después de ser tocado. Si los gusanos son nonresponsive, anotar muerto. De vez en cuando, un gusano no se moverá hacia atrás, pero puede presentar un ligero movimiento de la cabeza de lado a lado. Aunque técnicamente no es muerto, estos gusanos es casi seguro que vencerá en cuestión de horas, y deben ser marcados como muertos. Si uno espera demasiado tiempo para anotar los gusanos, la eclosión interna de la progenie puede ocurrir y estas "bolsas-de-gusanos" se puede romper, por lo que la detección de los cadáveres muy difícil. Retire ambos gusanos vivos y muertos de la placa que se computen para evitar conteos duplicados. Los gusanos vivos se pueden mover a una placa separada para realizar ensayos de comportamiento. La cantidad de gusanos que viven en relación con el total se representa como el% de gusanos supervivientes (Figura 1A </stRong>). 6. Toque Ensayo de Respuesta Una descripción detallada de este protocolo ha sido presentado en Hart, Anne C., ed. Comportamiento (3 de julio de 2006), WormBook, ed. El C. elegans Comunitaria de Investigación, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. Para anotar la respuesta táctil, identificar los gusanos que se mueven y toque ligeramente el lateral de la cabeza del tornillo sin fin (cerca de la parte media de la faringe), con una selección de pestañas (Figura 3). Si el gusano se mueve hacia atrás, anotar lo más sensible, si no, la puntuación por no ajustarse (Figura 1B). Repita este paso 10-15x para cada gusano con intervalos de 10 seg. Sonda al menos 10 gusanos en cada grupo para tener datos precisos. El mismo ensayo se puede usar para evaluar los cambios de locomoción hacia adelante siguiente toque ligero a la pared posterior del cuerpo. Asegúrese de no tocar la cabeza o la cola del gusano, ya que esto estimula un comportamiento distinto. Por último, encepas de control genético corporativos [N2 Bristol de tipo salvaje para, mec (mecanosensorial) mutante positivo para el negativo – por ejemplo CB1338 mec-3 (e1338) IV] para calibrar la fuerza con la que tocar los gusanos. Demasiado duro de un estímulo provocará una respuesta de comportamiento en los mutantes mec, demasiado poco no va a provocar un efecto en los controles de tipo salvaje N2. 7. Neuronal Modificaciones Para visualizar Post como modificaciones neuronales, utilizar una cepa que expresa GFP en las neuronas mec táctiles responden 4,5. Estas neuronas tienen largos procesos que se ejecutan a lo largo de la pared del cuerpo y son fácilmente anotó para anomalías morfológicas. Además, la información morfológica puede ser integrado con medidas de comportamiento de la función neuronal, como se describió anteriormente. Una cepa que se puede utilizar para este propósito es TU2583, que está disponible en el C Centro de Genética elegans y contiene el transgén integrado uIs25 expresando GFP from el promotor MEC-18, o alternativamente TU2562, que contiene un MEC-3 :: GFP fusión integrado. Preparar una almohadilla de agarosa. Derrita la agarosa al 2% en agua, traiga a 1x M9 con un 10x, y mantener la solución a 70 ° C. Coloque una gota (~ 20 l) de esta solución en un portaobjetos de vidrio (25 mm x 75 mm) que se ha colocado entre los otros dos diapositivas, cada uno de los cuales tienen una sola pieza de cinta adhesiva en su lado inferior. Coloque un portaobjetos de vidrio final perpendicular a la primera en la parte superior de la solución de agarosa al 2%, y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Esto debería formar una almohadilla que es el espesor de la cinta. Retire el carro superior y añadir 10 l de M9 que contenía 0,1% tetramisol, que inmovilizar a los gusanos. Mueva algunos (~ 10) viven gusanos en la diapositiva de agarosa al 2%. Coloque un cubreobjetos sobre ellos y visualizar GFP usando un microscopio de fluorescencia bajo un objetivo 100X con la iluminación apropiada. Estropeadoneuronas mostrarán una cadena citosólica de la membrana de patrón de perlas en los procesos, compuesto por punctum múltiple (Figura 2A), y / o anomalías en la que aparecen los procesos para ser rotas (Figura 2B). Número de punto lagrimal y anomalías en las neuronas para cada tornillo sin fin, utilizando un total de al menos 10 gusanos. 8. Cámara hipóxica Lab-hecho Un estilo Tupperware, envase sellado hermético puede readaptar como una cámara anóxica. Tenga cuidado al seleccionar un contenedor que es tan pequeño como sea posible. Un pequeño contenedor crea un ambiente hipóxico más rápido y es más fácil de encajar en el baño de agua (Figura 4). Haga dos agujeros en la tapa (se puede hacer con un destornillador o por calentamiento de fórceps y obligando a la tapa) e insertar un conector de plástico o metal que se ajusta el tubo (Figura 5A). Utilice pegamento que se puede colocar bajo el agua, y también se pone duro después del secado, evitando el movimiento deel conector y reducir por lo tanto la posibilidad de fugas (Figura 5B). El recipiente debe ser colocado en el baño de agua de modo que se sumerge por completo (Figura 4). Para sumergir el recipiente, use un peso de la botella o de un peso de buceo. Una de las conexiones de tubo se puede utilizar para introducir una mezcla de gas y el otro tubo actuará como un alivio de presión, por lo tanto, se debe dejar bajo el agua, de manera que el contenedor se sella del ambiente externo (Figura 4). La composición del aire se puede modular mediante el uso de gas por encargo, controladores de flujo de masa o cualquier aparato que mezcla los gases deseados. El flujo de gas debe ser controlado, como de alto flujo puede crear una evaporación excesiva. Por ejemplo, en un recipiente de 250 ml, 100 ml / min de gas proporcionará buen espacio para los gusanos y un fundente adecuado. La longitud del tubo debe mantenerse a un mínimo, ya que pueden ser permeables al gas, unallowing la entrada de O 2. Es importante evitar el uso de silicona, de Tygon tubos ya que estos materiales son permeables al intercambio de gases. Preferimos tubos de polipropileno o de nylon. Vidrio o la tubería de metal mantienen los gases bien, pero son también más difíciles de trabajar.