Isolering og karakterisering av nøytrofiler med anti-tumor egenskaper

Nøytrofile ble først karakterisert som det medfødte immunceller som fungerer som førstelinjeforsvar mot invaderende mikroorganismer. I dag er det kjent at nøytrofile har mer vidtrekkende funksjoner, være involvert i montering adaptive immunresponser mot fremmede antigener ^1,2, regulerer hematopoiesen ^3, angiogenese ⁴ og sårtilheling ^5. I tillegg kan neutrofiler påvirke tumorvekst og metastatisk progresjon i kraft av deres pro- og anti-tumoraktiviteter ^6,7. Neutrofiler er kjennetegnet ved et polymorft segmenterte kjerne (derfor betegnet polymorfonukleære (PMN) leukocytter) og inneholder minst tre distinkte undergrupper av granulater så vel som sekretoriske vesikler ⁸ (figur 1 A-C).

Neutrofiler ha høy fagocytisk kapasitet og høy NADPH oksidase aktivitet kritisk for mikrobiell eliminering, og utskiller en rekke kjemokiner viktige for attrekkraft ekstra nøytrofile og andre immunceller til området av betennelse ^8,9. Neutrofiler er kjennetegnet ved ekspresjon av en stor mengde av overflatereseptorer inkludert Toll-lignende reseptorer (TLR), C-type lektin reseptorer (CLRs), komplement-reseptor-3 (CD11b / CD18), og andre adhesjonsmolekyler (for eksempel L-selectin, LFA-1, VLA-4 og carcinoembryonic antigen-relaterte celleadhesjonsmolekyl 3 (CEACAM3 / CD66b)), kjemokin reseptorer (f.eks, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kjemotiltrekkende reseptorer (f.eks PAFR, LTB ₄ R og C5aR) , cytokinreseptorer (f.eks G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptid reseptorer (f.eks FPR1-3), og Fc reseptorer (f.eks CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) og CD64 (FcγRI) ^10. Hos mus er nøytrofile vanligvis identifisert som CD11b ⁺ Ly6G ^+, mens menneske nøytrofile er identifisert ved hjelp av CD11b, CD15, CD16 og CD66b leukocytter markører. Det er også generelt akseptert å farge for granule proteiner myeloperoksidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE) for påvisning av nøytrofile celler i vev.

Det er uklart hvorvidt de forskjellige funksjoner av nøytrofiler blir mediert av den samme celle, eller fra forskjellige celleunderpopulasjoner. Akkumulerende data tyder på nærvær av en heterogen nøytrofile populasjon som oppviser en høy grad av plastisitet påvirkes av pro-inflammatoriske stimuli og mikromiljøet ^11,12. Fridlender et al. ¹³ har grovt delt neutrofilene i kreft i to store underpopulasjoner kalt N1 med anti-tumor egenskaper og N2 med pro-tumor egenskaper. I kreft, så vel som i kronisk inflammasjon, er det en ytterligere undergruppe bestående av granulocytiske myeloide-avledede suppressor-celler (G-MDSCs) som undertrykker T-cellere ^14. G-MDSCs anses å være umodne myeloide celler kjennetegnet ved en CD11b ⁺ Ly6C^lav Ly6G ^hi fenotype hos mus ^15, samtidig som de har et CD15 ⁺ / CD16 ^lav fenotype i menneskelig ^16. G-MDSCs uttrykke høyere nivåer av arginase og myeloperoxidase, mens lavere nivåer av cytokiner og kjemokiner enn vanlige sirkulerende nøytrofile. De er mindre phagocytic og trekkfugl, men produserer høyere nivåer av ROS ^15,17,18. I det foreliggende papir vil vi beskrive noen grunnleggende metoder for isolering og karakterisering av neutrofiler med anti-tumor-egenskaper.

Mens nøytrofile utgjør den største bestanden av alle hvite blodceller i menneske sirkulasjon (45 – 70%, 1800 – 6000 / mikroliter), i mus, under normale forhold, de er ganske sparsom (10 – 15%, 300-500 / ul ). Nøytrofilantallet øker jevnt ved betennelse og tidvis i kreft, noe som representerer en tilstand av kronisk betennelse ^7. Nøytrofile utvikle seg fra multipotent felles myeloid forløper (CMP) cells i benmargen, gjennom en differensiering prosess passerer stadier av myeloblasts (MB), promyelocytter (PM), myelocytter (MC), metamyelocytter (MM) og band celler (BC) ^8. De modne, post-mitotiske nøytrofile kan forbli i benmarg for 4-7 dager før de blir frigitt til sirkulasjon ^8. Neutrofil omsetningen i blodet er vanligvis hurtig med en gjennomsnittlig halveringstid på 6-12 timer, noe som kan forlenges i henhold til inflammatoriske tilstander. Unstimulated nøytrofile har begrenset anti-tumorigent aktivitet, en funksjon som kan skaffes ved å utsette naive nøytrofile til chemokiner IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 og CXCL5 ^6,19 eller kunstig, ved å utsette dem til forbolester phorbol 12 -myristate 13-acetat (PMA) ^6.

Den korte halveringstid for blodneutrofiler sammen med det lave antallet nøytrofiler (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ oppnådd fra 1 ml blod fra et naivt 6 – 8 uker gamle mus, har gjort detvanskelig å utforske funksjonen av sirkulerende mus nøytrofile celler in vitro. For å overvinne denne vanskelighet, har andre kilder blitt brukt. For eksempel kan et stort antall neutrofiler fås fra benmargen ²⁰ eller peritoneum etter induksjon av steril inflammasjon (for eksempel etter intraperitoneal injeksjon av thioglycollate kjøttkraft eller Zymosan A). Det bør bemerkes at neutrofiler oppnådd fra bukhulen ikke utøve noen anti-tumorigen aktivitet (upublisert observasjon).

. Granot et al ⁶ observert at BALB / c mus inokulert orthotopically med mus 4T1 bryst carcinoma cellelinje utvikle neutrofili som forverrer med tumorprogresjon ⁶ (figur 2A), slik at 20-40 millioner blodneutrofiler kan lett isoleres fra 1 ml blod 3-4 uker etter tumorinokulasjon. Disse nøytrofile har kjøpt anti-tumor aktivitet, og har derfor vært coiNed tumor innblandet nøytrofile (TEN), for å skille dem fra naive nøytrofile ⁶ (figur 2B). Mens høy tetthet neutrofiler (HDN, Figur 1A) er sterkt anti-tumorigen, lav tetthet neutrofiler (LDN, figur 1B) som genereres i sammenheng med kreft har ikke ^21. Også høy tetthet nøytrofiler fra benmargen og milt av tumorbærende mus har anti-tumoraktivitet (upubliserte data). Det bør bemerkes at med tumorprogresjon milten blir gradvis forstørret (splenomegali), med økende mengder av nøytrofiler.

Det bør bemerkes at ti er også generert på andre modeller av kreft inkludert både spontane (MMTV-PyMT og MMTV-Wnt1 mammatumorer og K-Ras drevet lungesvulster) og injisert (AT-3 (MMTV-PyMT) og E0771 brystkreft celler, LLC Lewis lunge carcinoma celler og B16-F10 melanomceller). Imidlertid er omfanget av nøytrofil mobilisering i disse tumeller modeller er langt mindre enn for 4T1-mus inokulert, og nådde 5 – 10 x 10 ⁶ nøytrofiler i 1 ml blod etter 3 uker.