Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

I neutrofili sono stati inizialmente caratterizzati come le cellule immunitarie innate che servono come prima linea di difesa contro i microrganismi invasori. Oggi è noto che i neutrofili hanno più funzioni di vasta portata, essere coinvolti in montaggio le risposte immunitarie adattive contro antigeni estranei ^1,2, regolando emopoiesi ^3, l'angiogenesi e la guarigione delle ferite ^{4 5.} Inoltre, i neutrofili possono influenzare la crescita tumorale e nella progressione metastatica in virtù delle loro pro e anti-tumorali attività ^6,7. I neutrofili sono caratterizzati da un nucleo segmentato polimorfico (quindi definito polimorfonucleati (PMN) leucociti) e contenere almeno tre sottoclassi distinte di granuli e vescicole secretorie ⁸ (Figura 1A-C).

I neutrofili possiedono elevata capacità fagocitica e alta NADPH ossidasi critico per l'eliminazione microbica, e secernono una vasta gamma di chemochine importanti da untrazione dei neutrofili supplementari e di altre cellule immunitarie al sito di infiammazione ^8,9. I neutrofili si caratterizzano per l'espressione di una grande quantità di recettori di superficie, tra cui i recettori Toll-like (TLR), C-type lectina recettori (CLR), completano il recettore 3 (CD11b / CD18) e altre molecole di adesione (per esempio, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e Carcinoembrionario legati molecola di adesione delle cellule 3 (CEACAM3 / CD66b)), recettori per chemochine (ad esempio, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), i recettori chemotattiche (ad esempio, PAFR, LTB ₄ R e C5aR) , i recettori delle citochine (ad esempio, G-Cecoslovacchia, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptidi recettori (ad esempio, FPR1-3) e recettori Fc (ad esempio, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) e CD64 (FcγRI) ^10. Nei topi, i neutrofili sono solitamente identificati come CD11b ⁺ Ly6G ^+, mentre neutrofili umani vengono identificati utilizzando i marcatori di leucociti CD11b, CD15, CD16 e CD66b. Inoltre, è generalmente accettato di macchia per il proteine ​​granuli mieloperossidasi (MPO) e neutrofila (NE) per la rilevazione dei neutrofili nei tessuti.

Non è ancora chiaro se le diverse funzioni dei neutrofili sono mediate dalla stessa cellula o di cellule distinte sottopopolazioni. Dati accumulando suggeriscono la presenza di una popolazione eterogenea neutrofili che presenta un elevato grado di plasticità colpiti da stimoli pro-infiammatori e il microambiente ^11,12. Fridlender et al. ¹³ hanno grossolanamente diviso i neutrofili nel cancro in due grandi sotto-popolazioni chiamato N1 con proprietà anti-tumorali e N2 con proprietà pro-tumorali. Nel cancro, nonché in infiammazione cronica, vi è una sotto-popolazione supplementare composto di cellule mieloidi granulocitari derivate soppressori (G-MDSCs) che sopprimono le risposte delle cellule T ^14. G-MDSCs sono considerati cellule mieloidi immature caratterizzate da un CD11b ⁺ Ly6C^basso Ly6G fenotipo ^hi nei topi ^15, pur avendo una CD15 ⁺ / CD16 ^basso fenotipo in umano ^16. G-MDSCs esprimono alti livelli di arginasi e mieloperossidasi, mentre bassi livelli di citochine e chemochine che normali neutrofili circolanti. Sono meno fagociti e migratoria, ma producono alti livelli di ROS ^15,17,18. Nel presente lavoro descriveremo alcune metodologie di base per l'isolamento e la caratterizzazione dei neutrofili con proprietà antitumorali.

Mentre neutrofili costituiscono la più grande popolazione di tutte le cellule bianche del sangue nella circolazione umana (45 – 70%; 1.800 – 6.000 / ml), nei topi, in condizioni normali, sono piuttosto scarse (10 – 15%; 300-500 / ml ). La conta dei neutrofili aumenta costantemente su infiammazione e, occasionalmente, nel cancro, che rappresenta uno stato di infiammazione cronica ^7. I neutrofili si sviluppano da multipotenti precursore mieloide comune (CMP) cells nel midollo osseo, attraverso un processo di differenziazione che passano le fasi di mieloblasti (MB), promielociti (PM), mielociti (MC), metamielociti (MM) e cellule della band (BC) ^8. I maturi, neutrofili post-mitotico possono rimanere all'interno del midollo osseo per 4-7 giorni prima di essere rilasciati alla circolazione ^8. Fatturato dei neutrofili nel sangue è di solito rapido con una emivita media di 6-12 ore, che può essere prolungata in condizioni infiammatorie. Neutrofili non stimolate hanno limitato l'attività anti-cancerogena, una caratteristica che può essere acquisita esponendo i neutrofili naïve alle chemochine IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 ^6,19 o artificialmente, esponendoli a estere phorbol phorbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) ^6.

La breve emivita di neutrofili nel sangue insieme con il basso numero di neutrofili (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ ottenuto da 1 ml di sangue di un ingenuo 6-8 settimane di età del mouse, l'hanno fattadifficile da esplorare la funzione di far circolare il mouse neutrofili in vitro. Per superare questa difficoltà, sono state utilizzate altre fonti. Per esempio, un gran numero di neutrofili possono essere ottenute dal midollo osseo ²⁰ o il peritoneo dopo l'induzione dell'infiammazione sterile (ad esempio, dopo l'iniezione intraperitoneale di tioglicolato brodo o Zymosan A). Va notato che i neutrofili ottenuti dalla cavità peritoneale non esercitano alcuna attività anti-cancerogena (osservazioni non pubblicate).

. Granot et al ⁶ osservato che i topi BALB / c inoculati ortotopicamente con il mouse 4T1 seno linea cellulare di carcinoma sviluppare neutrofilia che aggrava con progressione tumorale ⁶ (Figura 2A), tale che 20-40.000.000 neutrofili sangue possono essere facilmente isolati da 1 ml di sangue 3 – 4 settimane dopo l'inoculazione del tumore. Questi neutrofili hanno acquisito le attività anti-tumorali, e di conseguenza sono stati coineutrofili ned tumorali trascinato (TEN), al fine di distinguerli dai neutrofili naïve ⁶ (Figura 2B). Mentre neutrofili alta densità (HDN, Figura 1A) sono altamente anti-oncogeno, neutrofili a bassa densità (LDN, Figura 1B) generate nel contesto di cancro non sono ^21. Inoltre, i neutrofili ad alta densità del midollo osseo e milza di topi portatori di tumore hanno attività anti-tumorale (dati non pubblicati). Va notato che, con progressione tumorale milza diventa gradualmente (splenomegalia), con quantità crescenti di neutrofili.

Va notato che TEN vengono generati anche in altri modelli di cancro inclusi sia spontanei (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 tumori mammari e k-Ras tumori polmonari motrice) e iniettato (AT-3 (MMTV-PyMT) e carcinoma mammario E0771 cellule, LLC Lewis cellule di carcinoma del polmone e cellule B16-F10 melanoma). Tuttavia, la misura di neutrofili mobilitazione in questi tumo modelli è molto meno di topi 4T1-inoculati, raggiungendo 5 – 10 x 10 ⁶ neutrofili in 1 ml di sangue dopo 3 settimane.