隔离和中性粒细胞的表征与抗肿瘤性质

嗜中性粒细胞被初步定性为它作为对抗入侵微生物的第一道防线的先天免疫细胞。目前已知有中性粒细胞更为深远的功能，被卷入安装适应性免疫反应对抗外来抗原^1,2，调节造血^3，4血管新生和伤口愈合^5。此外，嗜中性粒细胞可影响肿瘤的生长和转移进程凭借自己亲和抗肿瘤活性^6,7。嗜中性粒细胞的特征是多态分段核（因此称为多形核（PMN）白细胞）和含有颗粒的至少三个不同的亚类，以及分泌囊泡^8（ 图1A-C）。

嗜中性粒细胞具有较高的吞噬能力和高NADPH氧化酶的活性微生物消灭批判，并分泌一系列趋化因子在重要的牵引的附加 ​​中性粒细胞和其它免疫细胞到炎症^8,9的部位。嗜中性粒细胞的特征是大量的表面受体，包括Toll样受体（TLR）的表达，C型凝集素受体 ​​（的CLR），补体受体3（细胞CD11b / CD18）和其它粘附分子（ 例如，L-选择LFA-1，VLA-4和癌胚抗原相关细胞粘附分子3（CEACAM3 / CD66b）），趋化因子受体（ 例如，CXCR1，CXCR2，CCR1，CCR2），趋化因子受体（ 例如，PAFR，LTB ₄ R和C5aR的） ，细胞因子受体（ 例如，G-CSFR，IL-1R，IL-4R，IL-12R，IL-18R，TNFR），甲酰基肽受体（ 例如，FPR1-3），和Fc受体（ 例如，CD16（FcγRIII ），CD32（FcγRII），CD64和^{（FcγRI）10。}在小鼠中，中性粒细胞通常被认定为细胞CD11b ⁺ Ly6G ^+，而人类嗜中性粒细胞使用的CD11b，CD15，CD16和CD66b白细胞识别标志。它也被普遍接受染色的颗粒蛋白髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测组织中嗜中性粒细胞。

目前还不清楚是否嗜中性粒细胞的不同功能由同一小区或由不同的细胞亚群介导的。累积的数据表明了异种嗜中性白细胞群体表现出可塑性受促炎性刺激物和微环境^11,12的高度的存在。 Fridlender 等人 ¹³已经严重分割在癌症中的嗜中性粒细胞分成两个主要的亚群称为N1具有抗肿瘤性质和N2与亲肿瘤性质。在癌症中，以及在慢性炎症中，有一个附加的子种群粒髓源抑制细胞（G-肌源性干细胞），该抑制T细胞反应¹⁴组成。 G-肌源性干细胞被认为是其特征在于由一个细胞CD11b ⁺的Ly6C未成熟骨髓细胞^低 Ly6G ^喜表型的小鼠^15，而具有CD15 ⁺ / CD16 ^低人体¹⁶的表型。 G-肌源性干细胞表达更高水平的精氨酸酶和髓过氧化物酶，细胞因子和趋化因子比正常循环中性粒细胞，而较低的水平。他们不太吞噬和游走性，但产生较高水平的ROS ^15,17,18的。在本文中，我们将介绍一些基本的方法进行隔离中性粒细胞具有抗肿瘤特性和表征。

而中性粒细胞构成的所有白血细胞在人体循环的人口最多（45 – 70％; 1800 – 6000 /微升），在小鼠体内，正常情况下，他们是相当稀疏（10 – 15％; 300 – 500 /微升）。嗜中性粒细胞计数增加时炎症稳步偶尔在癌症，它代表的慢性炎症⁷的状态。嗜中性粒细胞多能，从普通的骨髓前体（CMP）CE开发LLS在骨髓，通过分化过程通过原粒细胞的阶段（MB），早幼粒细胞（PM），髓细胞（MC），晚幼（MM）和带细胞^（BC）8。成熟，有丝分裂后的中性粒细胞可以保持骨髓4内- 7日他们被释放到循环⁸之前。嗜中性粒细胞周转在血液通常是迅速，平均半衰期为6 – 12小时，这可能是炎症条件下延长。未刺激的嗜中性粒细胞已通过暴露于佛波醇酯佛波12不限抗肿瘤发生活性，可以通过使幼稚中性粒细胞的趋化因子IL-8（CXCL2），CCL2，CCL5和CXCL5 ^6,19或人工地获取的特征， -myristate 13-乙酸酯^{（PMA）6。}

短半衰期血中性粒细胞与低中性粒细胞数（约3 – 5×10 ^5）取血1ml的天真6实现- 8周旧鼠标，使人们艰难的探索循环中性粒细胞小鼠体外的功能。为了克服这个困难，其他来源的已被使用。例如，大量的中性粒细胞可以从骨髓²⁰或以下无菌炎症的诱导腹膜得到的（ 例如 ，腹膜内注射硫乙醇酸盐肉汤或酵母聚糖A的之后）。应当指出的是，从腹腔得到嗜中性粒细胞不施加任何抗肿瘤发生活性（未发表的观察）。

。Granot酒店等 ⁶观察到BALB / c小鼠接种原位用小鼠4T1乳腺癌细胞系开发嗜中性这恶化了与肿瘤进展^6（ 图2A），以使得20 – 40万血嗜中性粒细胞可以容易地从1毫升血液中分离3 – 第4周后，肿瘤接种。这些嗜中性粒细胞已获得抗肿瘤活性，并因此被瑰奈德肿瘤夹带中性粒细胞（TEN），以便从幼稚中性粒细胞^6（ 图2B）相区别。而高密度的中性粒细胞（HDN， 图1A）是高度抗肿瘤发生，在癌症的情况下产生的低密度中性粒细胞（LDN， 图1B）不是^21。另外，来自肿瘤携带小鼠的骨髓及脾脏高密度的中性粒细胞具有抗肿瘤活性（未发表数据）。应当指出的是，与肿瘤进展脾脏逐渐放大（脾肿大），以增加嗜中性粒细胞的数量。

应当指出的是，也被在癌症包括自发（MMTV-PyMT和MMTV-WNT1乳腺肿瘤和K-ras基因驱动的肺肿瘤）其他模型生成并注射（AT-3（MMTV-PyMT）和E0771乳腺癌TEN细胞，LLC Lewis肺癌细胞和B16-F10黑素瘤细胞）。然而，在这些TUM中性粒细胞动员的程度或模型远比4T1-接种小鼠的少，达到5 – 10×10 ⁶中性粒细胞在1ml血后3周。