Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Os neutrófilos foram inicialmente caracterizadas como sendo as células imunes inatos que servem como primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Hoje sabe-se que os neutrófilos funções têm maior alcance, estar envolvido na montagem de resposta imune adaptativa contra antígenos estranhos ^1,2, que regula a hematopoiese ^{3, 4} angiogênese e cicatrização de feridas ^5. Além disso, os neutrófilos podem afectar o crescimento do tumor metastático e a progressão em virtude das suas pro- e anti-tumorais actividades ^6,7. Os neutrófilos são caracterizados por um núcleo segmentado polimórfica (daqui denominado polimorfonucleares (PMN)) e contêm pelo menos três subclasses distintas de grânulos, bem como vesículas secretoras ⁸ (Figura 1A-C).

Os neutrófilos possuem elevada capacidade fagocítica e actividade da NADPH-oxidase alta crítica para a eliminação microbiana, e secretam uma vasta gama de quimiocinas importantes para atração de neutrófilos adicionais e outras células do sistema imunológico para o local da inflamação ^8,9. Os neutrófilos são caracterizados pela expressão de uma grande quantidade de receptores da superfície, incluindo os receptores semelhantes a Toll (TLRs), lectina do tipo C Receptores (CLRs), complementar do receptor 3 (CD11b / CD18) e outras moléculas de adesão (por exemplo, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e carcinoembrionário molécula relacionada com antigénio-adesão celular 3 (CEACAM3 / CD66b)), receptores de quimioquinas (por exemplo, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), quimioatractivas receptores (por exemplo, PAFR, _LTB4 R e C5aR) , receptores de citocinas (por exemplo, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptídicos dos receptores (por exemplo, FPR1-3), e receptores de Fc (por exemplo, CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII), e CD64 (FcyRI) ^10. Em ratinhos, os neutrófilos são geralmente identificados como CD11b ⁺ Ly6G ^+, enquanto que os neutrófilos humanos são identificadas utilizando os marcadores de leucócitos CD11b, CD15, CD16 e CD66b. É também geralmente aceite para corar para a mieloperoxidase proteínas dos grânulos (MPO) e elastase de neutrófilos (NE) para a detecção de neutrófilos em tecidos.

Ainda não é claro se as diversas funções dos neutrófilos são mediadas pela mesma célula ou por sub-populações de células distintas. Acumulando dados sugerem a presença de uma população heterogénea de neutrófilos que exibe um elevado grau de plasticidade afectado por estímulos pró-inflamatórios e o microambiente ^11,12. Fridlender et al. ¹³ ter grosseiramente divididos os neutrófilos no cancro em duas sub-populações principais denominado N1 com propriedades anti-tumorais e N2 com propriedades pró-tumorais. No cancro, bem como na inflamação crónica, há uma sub-população adicional constituído por células granulocíticas derivado supressoras mielóides (L-MDSCs) que suprimem as respostas de células T ^14. L-MDSCs são consideradas ser células mielóides imaturas caracterizadas por uma CD11b ⁺ Ly6C^baixo Ly6G fenótipo ^oi em camundongos ^15, ao ter um CD15 ⁺ / CD16 ^baixo fenótipo em humanos ^16. L-MDSCs expressar níveis mais elevados de arginase e mieloperoxidase, enquanto os níveis mais baixos de citocinas e quimiocinas que os neutrófilos circulantes normais. Eles são menos fagocíticas e migratório, mas produzem maiores níveis de ROS ^15,17,18. No presente artigo vamos descrever algumas metodologias básicas para isolamento e caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais.

Enquanto neutrófilos constituem a maior população de todas as células brancas do sangue na circulação humana (45 – 70%; 1800 – 6000 / mL), em ratos, sob condições normais, que são bastante escassos (10 – 15%; 300-500 / ul ). A contagem de neutrófilos aumenta de forma constante sobre a inflamação e, ocasionalmente, no cancro, o que representa um estado de inflamação crônica ^7. Os neutrófilos desenvolver a partir de precursor comum mielóide multipotentes (CMP) cells na medula óssea, por meio de um processo de diferenciação que passam as fases de mieloblastos (MB), promielócitos (PM), (MC) mielócitos, metamielócitos (mm) e as células de banda (BC) ^8. Os neutrófilos maduros, pós-mitóticas podem permanecer dentro da medula óssea para 4-7 dias antes de serem liberados para a circulação ^8. Volume de neutrófilos no sangue é geralmente rápida, com uma semi-vida média de 6-12 horas, que pode ser prolongado, sob condições inflamatórias. Neutrófilos não estimulados têm limitado actividade anti-tumorigénica, uma característica que pode ser adquirido por exposição dos neutrófilos sem tratamento prévio para as quimiocinas IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 ^6,19 ou artificialmente, expondo-as ao forbol de éster de forbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) ^6.

A meia-vida curta de neutrófilos do sangue em conjunto com o baixo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ obtido a partir de 1 ml de sangue de um naïve 6-8 week rato velho, tornaramdifícil explorar a função de neutrófilos circulantes rato in vitro. Para superar esta dificuldade, outras fontes têm sido usadas. Por exemplo, um grande número de neutrófilos podem ser obtidas da medula óssea ou do peritoneu ²⁰ após a indução da inflamação estéril (por exemplo, após injecção intraperitoneal de tioglicolato ou Zimosan A). Deve notar-se que os neutrófilos obtidos a partir da cavidade peritoneal não exercem qualquer actividade anti-tumorigénico (observação não publicada).

. Granot et al ⁶ observaram que os ratos BALB / c inoculados ortotopicamente com o rato linha celular de carcinoma da mama 4T1 desenvolver neutrofilia que agrava com a progressão do tumor ⁶ (Figura 2A), de tal modo que 20-40.000.000 neutrófilos do sangue pode ser facilmente isolado a partir de 1 ml de sangue 3 – 4 semanas pós-inoculação do tumor. Estes neutrófilos ter adquirido as actividades anti-tumorais, e tem sido nesse sentido coineutrófilos NED arrastado-tumorais (RTE), a fim de distingui-los dos neutrófilos ingênuos ⁶ (Figura 2B). Enquanto os neutrófilos de alta densidade (HDN, Figura 1A) são altamente anti-tumorigénica, neutrófilos baixa densidade (LDN, Figura 1B) geradas no contexto de cancro não são ^21. Além disso, os neutrófilos de alta densidade a partir da medula óssea e baço de ratinhos portadores de tumor têm uma actividade anti-tumoral (dados não publicados). Deve notar-se que, com a progressão do tumor torna-se gradualmente alargada baço (esplenomegalia), com quantidades crescentes de neutrófilos.

Deve-se notar que RT também são gerados em outros modelos de cancro, incluindo ambos os tumores mamários (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 e K-ras tumores pulmonares motrizes) espontâneos e injectado (AT-3 de ratinho (MMTV-PyMT) e carcinoma da mama E0771 células, LLC Lewis células de carcinoma de pulmão e células de melanoma B16-F10). No entanto, a extensão da mobilização de neutrófilos nestes tumou modelos é muito menos do que de ratos 4T1-inoculadas, atingindo 5-10 x 10 ⁶ neutrófilos em 1 ml de sangue após 3 semanas.