Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.
שידור סינפטי הוא תהליך מהיר מאוד. פוטנציאל פעולה מונע זרם של Ca 2 + למסוף presynaptic, באמצעות ערוצי מתח מגודרת סידן (VGCCs) ממוקמים בפני קרום שחרור, הוא הטריגר לאיחוי שלפוחית ושחרור הנוירוטרנסמיטר. חיוני למהירות של העברת הסינפטית הוא תיאום המרחב ובזמן בין הגעתו של פוטנציאל הפעולה, VGCCs ומכונות שחרור הנוירוטרנסמיטר. היכולת להקליט ישירות Ca 2 + זרמים מעל פני שחרור הקרום של מסופי presynaptic פרט הכרחית להבנה מדויקת של מערכת היחסים בין Ca presynaptic 2 + ושחרור הנוירוטרנסמיטר. גישה לפרצוף שחרור קרום presynaptic להקלטת אלקטרו אינה זמינה ברוב ההכנות וCa presynaptic 2 + כניסה התאפיינה תוך שימוש בטכניקות הדמיה וmeasureme הנוכחי מקרוסקופיתNTS – טכניקות שאין לי החלטה זמנית מספיק כדי לדמיין כניסת Ca 2 +. האפיון של VGCCs ישירות במסופי presynaptic אחת לא היה אפשרי בסינפסות מרכזיות ועד כה הושג בהצלחה רק בסינפסה גביע הסוג של גנגליון ריסי חומוס ובcalyces חולדה. יש לנו לטפל בהצלחה בבעיה זו בסינפסה reticulospinal הענק של חוט השדרה צמד ים על ידי פיתוח הכנה בחריפות ניתקת של חוט השדרה שמניב האקסונים reticulospinal מבודדים עם מסופי presynaptic פונקציונליים נטולי מבני postsynaptic. אנו fluorescently יכולים לתייג ולזהות מסופי presynaptic פרט ולמקד אותם להקלטה. שימוש בתכשיר זה, יש לנו מאופיין VGCCs ישירות בפרצוף שחרורו של מסופי presynaptic בודדים באמצעות אימונוהיסטוכימיה ואלקטרופיזיולוגיה גישות. Ca 2 + זרמים נרשמו ישירות בo קרום הפנים שחרורמסופי presynaptic פרט f, ההקלטה הראשונה מסוגו שבוצעו בסינפסות מרכזיות.
שידור סינפטי הוא תהליך מאוד מהיר ומדויק. פלישת פוטנציאל פעולה של מסוף presynaptic מובילה לפתיחת VGCCs ממוקם בקרום הפנים שחרור, העלייה וכתוצאה מכך Ca presynaptic 2 + מתנהגת כמו ההדק לשחרור איחוי שלפוחית ומוליך עצבי 1. כל הצעדים האלה להתרחש בתוך מאות מיקרו 2, ולכן דורש צימוד המרחבית הדוק של VGCCs למכונות איחוי שלפוחית 3. Ca 2 + והנתיבים Presynaptic מתאפיינים בעיקר באמצעות הדמיה גישות באמצעות הצבעים הרגישים Ca 2 + 4. Ca 2 + מאגרי שילוב המווסתים Ca 2 + בתאי עצב presynaptic נעשה שימוש כדי לאפיין את מערכת היחסים בין סידן ועצבי 3 presynaptic בעקיפין. בנוסף, ויסות Ca 2 + הריכוז החופשי presynaptic ידי משחרר רפרוף Ca 2 + 5 או הקלטת macroscopiג Ca 2 + זרמים היו בשימוש בשילוב עם אמצעים של איחוי שלפוחית ו / או שחרור; כגון מדידות קיבול 6 או postsynaptic תגובות 2 להתייחס לאותה השאלה. עם זאת, המאפיין את Ca 2 + זרמים ישירות בפרצוף השחרור, הסעיף מיוחד של קרום presynaptic בי שלילת קוטביות קרום מתורגמת לCa 2 + זרמים מפעילות איחוי שלפוחית הסינפטית ושחרור הנוירוטרנסמיטר, הוא חלק בלתי נפרד מהשגת מידה מדויקת של Ca 2 + דרישה לאיחוי שלפוחית הסינפטית. בנוסף, היכולת לאפיין באופן ישיר 2 + זרמי Ca במסופי presynaptic בודדים, בשילוב עם מדידות בו זמנית מדויקות של איחוי שלפוחית ושחרור מאפשר הבהרה מדויקת של מערכת היחסים בין עיתוי מהלך פוטנציאל פעולת הזמן, Ca 2 + נוכחי presynaptic, איחוי שלפוחית ושחרור. גישה לקרום הפנים שחרוראינו זמין ברוב המכריע של מסופי presynaptic בשל סגירת פרד על ידי דנדריטים postsynaptic. חוסר נגישות זה היה מכשול עיקרי באפיון של VGCCs שכן הוא מונע מדידות ישירות של זרם במסופי presynaptic פרט. אפיון ישיר של 2 + זרמי presynaptic Ca במסופי presynaptic בודדים עד כה לא היה אפשרי בסינפסות מרכזיות והושג רק בשני מסופי presynaptic סוג calyceal; סינפסה גביע הסוג של calyces גנגליון ריסי חומוס 7-10 וחולדת 11,12. בכל מסופי presynaptic האחרים, כולל סינפסה reticulospinal הענק בחוט השדרה צמד ים 13, היעדר הגישה לקרום הפנים שחרור סינפטי יש חייבת השימוש בגישות עקיפות כגון ההדמיה Ca 2 + ללמוד Ca 2 + והנתיבים presynaptic.
<img alt="איור 1" fo: תוכן רוחב = "src" "5in" = "/ קבצים / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" width = "500" />
איור 1 צמד ים סינפסה reticulospinal הענק. (א) חתך של חוט השדרה צמד ים המצביע על הנטייה dorso- הגחון. האקסונים Reticulospinal מסומנים בכוכבית ירוקה. (ב) שיקום 3-D של סינפסה reticulospinal בחוט השדרה צמד ים מראה האקסון presynaptic reticulospinal עושה רב en קשר אגב (מסומנים בחצים ירוקים) אל הנוירון postsynaptic 13. מסופי Presynaptic סומנו בתווית עם אלקסה פלואוריד 488 hydrazide phalloidin מצומדות (ירוק), בזמן שהנוירון postsynaptic כבר מלא בhydrazide אלקסה פלואוריד 568 (אדום).
האקסונים reticulospinal ענק צמד ים, הממוקמים באזור הגחון של מקביל בחוט השדרה לאיור 1 א ציר מקורי, זנב, מרובה טופס es קשר אגב הסינפטי על תאי עצב שלקרן השדרה הגחון 14 איור 1b 13. כל תא מקרוסקופית זרמי Ca 2 + נרשמו מהאקסונים reticulospinal בחוט השדרה שלם 13,15. עם זאת, ניסיונות עיוורים קודמים במדידה ישירה של Ca 2 + זרמים באקסונים reticulospinal בכבל צמד ים שלם השדרה באמצעות טכניקת מהדק תיקון מצורף תא הוכיחו לא מוצלחים 13 בשל חוסר הגישה לקרום הפנים שחרור סינפטי בשל תהליכי postsynaptic מתנגדים איור 1b. פני שחרור הקרום נעשה בעבר נגיש על ידי ההסרה של הנוירון postsynaptic 11, ההפרעות מכאניות של סינפסה לפני הקלטת 12 או טיפול אנזימטי בשילוב עם ניתוק מכאני 16. בהתחשב בארגון המורכב של חוט השדרה, זה יהיה קשה מאוד להוכיח לזהות נוירון postsynaptic ולחזור בו באופן מכאני או להפריע הסינפסה דואר. לפיכך, החלטנו להשתמש בטיפול אנזימטי 17 אחרי ניתוק מכאני.
שימוש בגישה זו, פיתחנו הכנה בחריפות ניתקת של חוט השדרה צמד שמניב האקסונים reticulospinal מבודדים קיימא עם מסופי presynaptic פונקציונליים נטול כל תהליכי postsynaptic, ובכך לספק גישה חופשית למסופי presynaptic פרט. בשיתוף עם מיקרוסקופ רגיל הפוך ודימות פלואורסצנטי, זה מאפשר לנו לזהות ולמקד את מסופי presynaptic מזוהה fluorescently בודדים, עם טפטפת תיקון המכיל פתרון הקלטה שמבודד 4d איור 4C ואיור 2 + זרמי Ca, להקלטה באמצעות תאי ד' טכניקת מתח מהדק מצורף. Ca 2 + זרמים נרשמו ישירות בקרום הפנים שחרור presynaptic של 4F איור מסופי presynaptic פרט. זה significant פריצת הדרך בתחום של שידור סינפטי שכן הוא ההקלטה הראשונה מסוג זה בוצע בסינפסות מרכזיות.
פרוטוקול הניתוק שלנו הוא משמעותי על ידי מניב האקסונים reticulospinal מבודדים נטולי 2f איור תחזיות postsynaptic, אך בכל זאת לשמור על 4d איור 4C מסופים ואיור presynaptic הפונקציונלי. היעדר תהליכי postsynaptic המנוגדים מסוף presynaptic מאפשר גישה ישירה להקלטת קרום הפנים שחר…
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA.
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.2 µm syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
22×60 mm coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
Antifreeze | Prestone | ||
Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
High vacuum grease | Dow-Corning | ||
Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
Industrial grade Nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
Petri dish 100×15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
Petri dish 35×10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300000 |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Primary antibodiesR-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
Protease Type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
Schot Duran Preesure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
Slicing chamber | Leica Biosystems | 1.4046E+10 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium hydroxide | S8045 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
Xenon lamp | Nikon |