Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Synaptischen Übertragung ist eine extrem schnelle und präzise Prozess. Aktionspotential Invasion der präsynaptischen Terminal führt zum Öffnen VGCCs in der Trennfläche Membran, die daraus resultierende Erhöhung der präsynaptischen Ca2 ⁺ als Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern ¹ wirkenden entfernt. Alle diese Schritte werden innerhalb von hundert Mikrosekunden ^2, und erfordern daher enge räumliche Kopplung von VGCCs auf die Fusion von Vesikeln Maschinen ^3. Präsynaptischen Ca2 ⁺ Flüsse wurden in erster Linie durch bildgebende Ansätze mit Ca2 ^+-sensitiven Farbstoffen ⁴ gekennzeichnet. Einbau Ca ^{2 +-Puffer,} die Ca ^{2 +} modulieren präsynaptischen Neuronen wurde verwendet, um indirekt zu charakterisieren, die die Beziehung zwischen präsynaptischen Calcium und Neurotransmission ^3. Darüber hinaus Modulation der präsynaptischen Ca2 ^{+-Konzentration} frei von Uncaging Ca ^{2 + 5} oder Aufnahme macroscopic Ca ^{2 +} Strömungen in Verbindung mit Maßnahmen der Fusion von Vesikeln und / oder Freisetzung verwendet; wie Kapazitätsmessungen ⁶ oder postsynaptischen Antworten ^2, um die gleiche Frage anzugehen. Allerdings Charakterisierung Ca2 ⁺ Ströme direkt an der Trennfläche, die Fachgruppe der präsynaptischen Membran, wo Depolarisation der Membran ist in Ca ^{2 +} übersetzt Ströme Auslösung synaptischen Vesikel Fusion und Freisetzung von Neurotransmittern, ist integraler Bestandteil erhalten eine genaue Messung der Ca ^{2 +} Voraussetzung für die synaptischen Vesikel Fusion. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, direkt zu charakterisieren Ca2 ⁺ Ströme an einzelnen präsynaptischen Enden, verbunden mit genauen gleichzeitige Messungen Vesikelverschmelzung und Freisetzung ermöglicht eine genaue Erläuterung der zeitlichen Beziehung zwischen dem Zeitverlauf des Aktionspotentials, präsynaptischen Ca ^{2 +} Strom, Fusion von Vesikeln und loslassen. Zugriff auf die Trennfläche Membranist nicht in der Mehrheit der präsynaptischen Enden durch Anlagerung von den postsynaptischen Dendriten zu schließen. Diese Unzugänglichkeit ist ein großes Hindernis bei der Charakterisierung von VGCCs, da es verhindert, dass direkte Messungen von Strom an einzelnen präsynaptischen Terminals. Direkte Charakterisierung der präsynaptischen Ca2 ⁺ Ströme bei einzelnen präsynaptischen bisher nicht im Zentrum von Synapsen möglich und wurde nur in zwei Kelchtyp präsynaptischen erreicht worden; Kelch-Typ-Synapse der Küken Ciliarganglion ^7-10 und Ratten Kelche ^11,12. In allen anderen präsynaptischen einschließlich der riesigen retikulospinale Synapse in der Neunauge Rückenmark ^13, hat der Mangel an Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche die Verwendung der indirekten Ansätze notwendig, wie Ca ^{2 +-Bildgebung} zu präsynaptischen Ca2 ⁺ Flüsse zu studieren.

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Abbildung 1. Neunauge Riesen retikulospinale Synapse. (A) Querschnitt von Neunauge Rückenmark zeigt dorso-ventralen Ausrichtung. Retikulospinale Axone sind mit grünen Stern markiert. (B) 3-D-Rekonstruktion des retikulospinale Synapse im Rückenmark, die Neunauge präsynaptischen Axon retikulospinale machen zahlreiche en passant Kontakte (durch grüne Pfeile markiert) auf der postsynaptischen Neuron ^13. Präsynaptischen Terminals wurden mit Alexa Fluor 488 Hydrazid Phalloidin (grün) markiert worden, während der postsynaptischen Neuron mit Alexa Fluor 568 Hydrazid (rot) gefüllt wurde.

Neunauge Riesen retikulospinale Axone, in der ventralen Region des Rückenmarks parallel zur rostral-kaudale Achse 1a, Form mehrerer en passant synaptische Kontakte liegt auf Neuronen desVorderhorn des Rücken ¹⁴ 1b ^13. Makroskopischen Ganzzell Ca2 ⁺ Ströme wurden von retikulospinale Axone im Rückenmark intakt ^13,15 aufgezeichnet. Allerdings vorherigen Blindversuche direkte Messung von Ca2 ⁺ Ströme in retikulospinale Axone im Rückenmark intakt Neunauge mit Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik erfolglos ¹³ aufgrund fehlender Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche durch den gegenüberliegenden postsynaptischen Prozesse bewährt Abbildung 1b. Die Trennfläche Membran zuvor zugänglich durch Entfernen der postsynaptischen Neuron ^11, mechanische Störung des Synapse vor der Aufzeichnung ¹² oder enzymatische Behandlung in Verbindung mit mechanischer Dissoziation ¹⁶ hergestellt. Angesichts der komplexen Organisation des Rückenmarks, kann es äußerst schwierig sein würde, die postsynaptischen Neuron identifizieren und zurückgezogen werden mechanisch oder stören the Synapse. Daher haben wir beschlossen, enzymatische Behandlung ^17, gefolgt von mechanischen Dissoziation zu verwenden.

Mit diesem Ansatz haben wir eine akut dissoziierten Vorbereitung der Neunauge Rückenmark, das lebensfähig isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen ohne jegliche postsynaptischen Prozesse ergibt entwickelt, wodurch eine uneingeschränkte Zugriff auf die einzelnen präsynaptischen Terminals. In Verbindung mit einem Standard-Umkehrmikroskop und Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht es uns zu erkennen und gezielt einzelne fluoreszenz identifiziert präsynaptischen Terminals, mit einer Patch-Pipette, die eine Aufzeichnungslösung, die Ca ^{2 +} Ströme 4c und 4d-Isolate, für die Aufnahme mit zell angebracht Voltage-Clamp-Technik. Ca ^{2 +} Ströme wurden direkt an der präsynaptischen Membran Trennfläche der einzelnen präsynaptischen 4f aufgezeichnet. Dies ist eine significaNT im Bereich der synaptischen Übertragung Durchbruch, da es die erste derartige Aufnahme bei zentralen Synapsen durchgeführt werden soll.