Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido y preciso. Acción potencial invasión de la terminal presináptica conduce a la apertura de VGCCs situados en la membrana cara liberación, el aumento resultante en presináptica Ca ^{2 +} que actúa como el disparador para la fusión de vesículas y liberación de neurotransmisores ^1. Todos estos pasos se dan dentro de cientos de microsegundos ^2, y por lo tanto requieren de acoplamiento espacial estricto de VGCCs a la maquinaria de la fusión de vesículas ^3. Presináptica Ca ^{2 +} flujos se han caracterizado principalmente por medio de imágenes enfoques usando colorantes sensibles al Ca ^{2 + 4.} La incorporación de Ca ^{2 +} tampones que modulan Ca2 ⁺ en las neuronas presinápticas se ha utilizado para caracterizar indirectamente la relación entre el calcio y la neurotransmisión presináptica ^3. Además, la modulación de la presináptica libre de Ca ^{2 +} de concentración por uncaging Ca ^{2 + 5} o grabar macroscopic Ca ^{2 +} corrientes se han usado en conjunción con medidas de la fusión de vesículas y / o liberación; tales como medidas de capacitancia ⁶ o postsináptica respuestas ² para abordar la misma cuestión. Sin embargo, la caracterización de Ca ^{2 +} corrientes directamente en la cara de la liberación, la sección especializada de la membrana presináptica, donde despolarización de la membrana se traduce en Ca ^{2 +} corrientes desencadenan la fusión de vesículas sinápticas y la liberación de neurotransmisores, es esencial para obtener una medida precisa de la Ca ^{2 +} requisito para la fusión de la vesícula sináptica. Además, la capacidad para caracterizar directamente Ca ^{2 +} corrientes en los terminales presinápticos individuales, junto con mediciones simultáneas precisas de la fusión de vesículas y liberación permite una elucidación precisa de la relación de temporización entre el transcurso de tiempo del potencial de acción, presináptica Ca ^{2 +} actual, la fusión de vesículas y la liberación. El acceso a la membrana de liberación carano está disponible en la mayoría de los terminales presinápticos debido a la estrecha aposición por las dendritas postsinápticas. Esta inaccesibilidad ha sido un obstáculo importante en la caracterización de VGCCs ya que impide las mediciones directas de la corriente en las terminales presinápticas individuales. Caracterización directa de presináptica Ca ^{2 +} corrientes en las terminales presinápticas individuales hasta el momento no ha sido posible en las sinapsis centrales y sólo se ha logrado en dos terminales presinápticas tipo cálices; tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo ^{de 7-10} y de rata cálices ^11,12. En todos los otros terminales presinápticas incluyendo la sinapsis reticulospinal gigante en la lamprea de la médula espinal ^13, la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica ha hecho necesario el uso de enfoques indirectos tales como Ca ^{2 +} de imágenes para estudiar presináptica Ca ^{2 +} flujos.

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Figura sinapsis reticulospinal gigante. (A) Sección 1.-Lamprea de lamprea médula espinal que indica la orientación dorso-ventral. Reticuloespinal axones están marcados con el asterisco verde. (B) la reconstrucción 3-D de la sinapsis reticuloespinal en la lamprea de la médula espinal que muestra presináptica del axón reticuloespinal hacer numerosos contactos en passant (marcado por flechas verdes) en la neurona postsináptica ^13. Terminales presinápticas han sido etiquetados con Alexa Fluor 488 hidrazida conjugado faloidina (verde), mientras que la neurona postsináptica se ha llenado con Alexa Fluor 568 hidrazida (rojo).

Axones gigantes reticulospinales lamprea, ubicadas en la región ventral de la médula espinal en paralelo a la rostral-caudal eje Figura 1a, la forma múltiple en passant contactos sinápticos en neuronas de laasta ventral de la médula ¹⁴ Figura 1b ^13. De células enteras macroscópica Ca ^{2 +} corrientes han sido registrados en los axones reticulospinales en la médula espinal intacta ^13,15. Sin embargo, los intentos anteriores ciegos en la medición directa de Ca ^{2 +} corrientes en los axones reticulospinales en la lamprea intacta la médula espinal usando técnica de patch clamp de células inscritos han tenido éxito ¹³ debido a la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica debido a los procesos postsinápticos opuestas la Figura 1b. La membrana cara liberación ha sido previamente hecho accesible por la eliminación de la neurona postsináptica ^11, perturbación mecánica de la sinapsis antes de grabar ¹² o el tratamiento enzimático junto con disociación mecánica ^16. Dada la compleja organización de la médula espinal, que resultaría extremadamente difícil identificar la neurona postsináptica y retraer mecánicamente o perturbar ªe sinapsis. Por lo tanto, hemos decidido utilizar el tratamiento enzimático ¹⁷ seguido por disociación mecánica.

Con este enfoque, hemos desarrollado una preparación agudamente disociado de la lamprea de la médula espinal que produce viables axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de cualquier proceso de post-sinápticos, proporcionando así un acceso sin restricciones a las terminales presinápticas individuales. En conjunto con un microscopio invertido y estándar de imágenes de fluorescencia, que nos permite identificar y seleccionar los terminales presinápticos con fluorescencia identificado individuales, con una pipeta de parche que contiene una solución de grabación que aísla Ca ^{2 +} corrientes 4c figura y la figura 4d, para la grabación con base celular técnica de fijación de voltaje adjunta. Ca ^{2 +} corrientes se han registrado directamente en la membrana cara liberación presináptica de los terminales presinápticos individuo Figura 4f. Esta es una SIGNIFICAnt avance en el campo de la transmisión sináptica, ya que es la primera grabación que se llevó a cabo en las sinapsis centrales.