Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido e preciso. Azione potenziale invasione del terminale presinaptico porta all'apertura dei VGCCs situati nella membrana di rilascio viso, il conseguente aumento della presinaptico Ca ^{2 +} che funge da innesco per la fusione della vescicola e neurotrasmettitore rilascio ^1. Tutti questi passaggi si verificano all'interno di centinaia di microsecondi ^2, e quindi richiedono accoppiamento spaziale stretto VGCCs alle macchine di fusione delle vescicole ^3. Presinaptici Ca ^{2 +} flussi sono stati caratterizzati principalmente attraverso approcci di imaging utilizzando Ca ^{2 +} coloranti sensibili ^4. Integrare Ca ^{2 +} buffer che modulano Ca ^{2 +} nei neuroni presinaptici è stato utilizzato per caratterizzare indirettamente il rapporto tra calcio presinaptico e neurotrasmissione ^3. Inoltre, modulando la presinaptico libera Ca ^{2 +} concentrazione da uncaging Ca ^{2 + 5} o registrazione macroscopic Ca ^{2 +} correnti sono stati utilizzati in combinazione con misure di fusione della vescicola e / o rilascio; quali misure di capacità ^{di 6} o postsinaptici ² risposte per affrontare la stessa domanda. Tuttavia, caratterizzando Ca ^{2 +} correnti direttamente in faccia rilascio, la sezione specializzata della membrana presinaptica dove depolarizzazione della membrana viene tradotto in Ca ^{2 +} correnti di attivazione sinaptica fusione delle vescicole e il rilascio dei neurotrasmettitori, è parte integrante di ottenere una misura precisa del Ca ^{2 +} requisito per la fusione delle vescicole sinaptiche. Inoltre, la capacità di caratterizzare direttamente Ca ^{2 +} correnti a singoli terminali presinaptici, accoppiato con misure simultanee accurate di fusione della vescicola e rilascio permette una spiegazione precisa della relazione temporale tra l'andamento temporale del potenziale d'azione, presinaptico Ca ^{2 +} corrente, fusione della vescicola e rilascio. L'accesso alla membrana di rilascio visonon è disponibile nella maggior parte dei terminali presinaptici dovuti a chiudere apposizione da parte dei dendriti postsinaptici. Questa inaccessibilità è stato un grande ostacolo nella caratterizzazione di VGCCs quanto impedisce misure dirette di corrente a singoli terminali presinaptici. Caratterizzazione diretta di presinaptici Ca ^{2 +} correnti a singoli terminali presinaptici non è finora stato possibile in sinapsi centrali ed è stato raggiunto solo in due terminali presinaptici di tipo caliceale; calice-tipo sinapsi delle pulcino ganglio ciliare ^7-10 e ratto calici ^11,12. In tutti gli altri terminali presinaptici tra cui la sinapsi reticulospinal gigante nella lampreda midollo spinale ^13, la mancanza di accesso alla membrana di rilascio volto presinaptica ha reso necessario l'utilizzo di approcci indiretti come Ca ^{2 +} di imaging per studiare presinaptici Ca ^{2 +} flussi.

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Figura 1 Lampreda gigante sinapsi reticulospinal. (A) Sezione di lampreda midollo spinale che indica l'orientamento dorso-ventrale. Assoni reticulospinal sono contrassegnati dall'asterisco verde. (B) 3-D ricostruzione della sinapsi reticulospinal nella lampreda midollo spinale che mostra presinaptico assone reticulospinal facendo numerosi en passant contatti (contrassegnato da frecce verdi) sul neurone postsinaptico ^13. Terminali presinaptici sono stati etichettati con Alexa Fluor 488 hydrazide falloidina coniugato (verde), mentre il neurone postsinaptico è stato riempito con Alexa Fluor 568 hydrazide (rosso).

Lampreda assoni giganti reticulospinal, situato nella regione ventrale del midollo spinale parallelo al rostrale-caudale asse Figura 1a, forma multipla en passant contatti sinaptici sui neuroni delspinale corno ventrale ¹⁴ Figura 1b ^13. Whole-cell macroscopica Ca ^{2 +} correnti sono state registrate da assoni reticulospinal nel midollo spinale intatto ^13,15. Tuttavia, precedenti tentativi ciechi a misura diretta di Ca ^{2 +} correnti in assoni reticulospinal nel intatta lampreda midollo spinale utilizzando cellule-attached tecnica del patch clamp hanno provato senza successo ¹³ a causa della mancanza di accesso alla membrana presinaptica rilascio volto a causa dei processi di postsinaptici opposte Figura 1b. La membrana di rilascio volto è stato in precedenza reso accessibile dalla rimozione del neurone postsinaptico ^11, perturbazione meccanica della sinapsi prima di registrare ¹² o trattamento enzimatico accoppiato con dissociazione meccanica ^16. Data la complessa organizzazione del midollo spinale, che si sarebbe rivelato estremamente difficile identificare il neurone postsinaptico e ritrarre meccanicamente o perturbare the sinapsi. Quindi, abbiamo deciso di utilizzare il trattamento enzimatico ¹⁷ seguita da dissociazione meccanica.

Usando questo approccio, abbiamo sviluppato una preparazione acutamente dissociata della lampreda midollo spinale che produce vitali isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali privi di qualsiasi processo post-sinaptici, fornendo così un accesso illimitato ai singoli terminali presinaptici. In combinazione con un microscopio invertito e standard di imaging di fluorescenza, che ci permette di identificare e indirizzare i singoli terminali presinaptici fluorescenti-identificato, con una pipetta di patch contenente una soluzione di registrazione che isola Ca ^{2 +} correnti figura 4c e 4d figura, per la registrazione utilizzando cellulo- allegato tecnica voltage-clamp. Ca ^{2 +} correnti sono state registrate direttamente a livello della membrana presinaptica del rilascio volto dell'individuo terminali presinaptici figura 4f. Questo è un significant passo avanti nel campo della trasmissione sinaptica poiché è la prima di tali registrazioni da effettuare in sinapsi centrali.