七鳃鳗网状脊髓轴突急性分解到从单个功能突触前终端剥离面膜启用记录

突触传递是极其快速和精确的过程。动作电位在突触前终端的入侵导致了开放位于剥离面的膜，由此带来的突触前^钙作为触发的囊泡融合和神经递质的释放¹ VGCCs的。所有这些步骤发生几百微秒²的范围内，并因此需要VGCCs的囊泡融合机械³的紧空间耦合。突触前^钙离子通量一直主要通过影像学方法，使用^钙离子敏感的染料⁴特点。结合^的 Ca ^{2 +}的缓冲液调制^的 Ca ^{2 +}在突触前神经元已被用于间接地表征突触前钙和神经传递³之间的关系。另外，通过解笼锁^的 Ca ^{2 + 5}或记录macroscopi调节突触前游离^的 Ca ^{2 +}浓度Ç ^的 Ca ^{2 +}电流，一直配合使用囊泡融合和/或释放的措施;如电容测量⁶或突触后反应^2，解决同样的问题。然而， ^离子电流直接剥离面表征钙，突触前膜的特殊部分，其中膜去极化转化为^钙离子电流，引发突触囊泡融合和神经递质的释放，是不可或缺的获得钙的精确测量^离子要求突触囊泡融合。此外，能够直接在个人突触前末梢表征^的 Ca ^{2 +}电流，加上囊泡融合和释放的精确同步测量允许的动作电位时程之间的定时关系的精确澄清，突触前^的 Ca ^{2 +}电流，囊泡融合和释放。访问该释放面膜是不是在大多数由于通过突触后树突关闭并置的突触前末梢的提供。这交通不便一直在VGCCs的特性的一大障碍，因为它可以防止电流的个体突触前终端的直接测量。突触前^钙电流个别突触前终端的直接表征迄今未能在中央突触，并只有两个肾盏型突触前终端已经实现;小鸡睫状神经节^7-10和大鼠肾盏^11,12的花萼型突触。在所有其它突触前的终端包括七鳃鳗脊髓¹³巨网状脊髓突触，缺乏进入突触前释放的脸膜因此有必要采用间接的方法，如^钙成像研究突触前^钙离子通量。

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图1：七鳃鳗巨型网状脊髓突触。（一）横截面七鳃鳗脊髓表明背腹方向。网状脊髓轴突都标有绿色星号（B）3-D中的网状脊髓突触中的七鳃鳗脊髓显示突触前网状脊髓轴突使得无数顺便接点（标记绿色箭头）到突触后神经元¹³的重建。突触前终端已经被标记的Alexa Fluor 488的酰肼轭毒伞素（绿色），而突触后神经元已经充满的Alexa Fluor 568的酰肼（红色）。

鳗巨型网状脊髓轴突，位于平行脊髓延髓-尾轴图1a，形式多种顺便突触联系的腹侧区域上的神经元脊髓前角¹⁴ 图1b ^13。在完整的脊髓^13,15宏观全细胞^钙电流已经记录从网状脊髓轴突。然而，以往的盲目尝试直接测量的Ca ^{2 +}电流在用细胞贴附膜片钳技术的完整的七鳃鳗脊髓网状脊髓轴突已经证明不成功的¹³由于缺乏进入突触前释放的脸膜由于反对突触后处理图1b。剥离面膜已经预先，记 ​​录¹²或酶处理加上机械解离¹⁶前突触的机械扰动进行访问除去突触后神经元^11。给出的脊髓的复合组织，其将被证明非常难以识别突触后神经元上和机械缩回它​​或扰乱日ê突触。因此，我们决定用酶处理¹⁷接着机械解离。

使用这种方法，我们已经开发了一种急性分离的七鳃鳗脊髓能够产生可行的隔离网状脊髓轴突与功能性的突触前终端没有任何突触后过程的准备，从而提供不受限制的访问单个突触前终端。在一个标准的倒置显微镜和荧光成像相结合，它使我们能够识别并锁定个人荧光鉴定突触前末梢，用补丁吸管含录音解决方案，隔离^的 Ca ^{2 +}电流图4c和图4d，使用小区记录附加电压钳技术。 ^钙离子电流已在个别突触前末梢图4F突触前释放的脸膜直接记录。这是一个标志意义NT突破突触传递的领域，因为它是第一个这样的记录来进行，在中央突触。