החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

שידור סינפטי הוא תהליך מאוד מהיר ומדויק. פלישת פוטנציאל פעולה של מסוף presynaptic מובילה לפתיחת VGCCs ממוקם בקרום הפנים שחרור, העלייה וכתוצאה מכך Ca presynaptic ^{2 +} מתנהגת כמו ההדק לשחרור איחוי שלפוחית ​​ומוליך עצבי ^1. כל הצעדים האלה להתרחש בתוך מאות מיקרו ^2, ולכן דורש צימוד המרחבית הדוק של VGCCs למכונות איחוי שלפוחית ^​​3. Ca ^{2 +} והנתיבים Presynaptic מתאפיינים בעיקר באמצעות הדמיה גישות באמצעות הצבעים הרגישים Ca ^{2 + 4.} Ca ^{2 +} מאגרי שילוב המווסתים Ca ^{2 +} בתאי עצב presynaptic נעשה שימוש כדי לאפיין את מערכת היחסים בין סידן ועצבי ³ presynaptic בעקיפין. בנוסף, ויסות Ca ^{2 +} הריכוז החופשי presynaptic ידי משחרר רפרוף Ca ^{2 + 5} או הקלטת macroscopiג Ca ^{2 +} זרמים היו בשימוש בשילוב עם אמצעים של איחוי שלפוחית ​​ו / או שחרור; כגון מדידות קיבול ⁶ או postsynaptic תגובות ² להתייחס לאותה השאלה. עם זאת, המאפיין את Ca ^{2 +} זרמים ישירות בפרצוף השחרור, הסעיף מיוחד של קרום presynaptic בי שלילת קוטביות קרום מתורגמת לCa ^{2 +} זרמים מפעילות איחוי שלפוחית ​​הסינפטית ושחרור הנוירוטרנסמיטר, הוא חלק בלתי נפרד מהשגת מידה מדויקת של Ca ^{2 +} דרישה לאיחוי שלפוחית ​​הסינפטית. בנוסף, היכולת לאפיין באופן ישיר ^{2 +} זרמי Ca במסופי presynaptic בודדים, בשילוב עם מדידות בו זמנית מדויקות של איחוי שלפוחית ​​ושחרור מאפשר הבהרה מדויקת של מערכת היחסים בין עיתוי מהלך פוטנציאל פעולת הזמן, Ca ^{2 +} נוכחי presynaptic, איחוי שלפוחית ​​ושחרור. גישה לקרום הפנים שחרוראינו זמין ברוב המכריע של מסופי presynaptic בשל סגירת פרד על ידי דנדריטים postsynaptic. חוסר נגישות זה היה מכשול עיקרי באפיון של VGCCs שכן הוא מונע מדידות ישירות של זרם במסופי presynaptic פרט. אפיון ישיר של ^{2 +} זרמי presynaptic Ca במסופי presynaptic בודדים עד כה לא היה אפשרי בסינפסות מרכזיות והושג רק בשני מסופי presynaptic סוג calyceal; סינפסה גביע הסוג של calyces גנגליון ריסי חומוס ^7-10 וחולדת ^11,12. בכל מסופי presynaptic האחרים, כולל סינפסה reticulospinal הענק בחוט השדרה צמד ים ^13, היעדר הגישה לקרום הפנים שחרור סינפטי יש חייבת השימוש בגישות עקיפות כגון ההדמיה Ca ^{2 +} ללמוד Ca ^{2 +} והנתיבים presynaptic.

<img alt="איור 1" fo: תוכן רוחב = "src" "5in" = "/ קבצים / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" width = "500" />
איור 1 צמד ים סינפסה reticulospinal הענק. (א) חתך של חוט השדרה צמד ים המצביע על הנטייה dorso- הגחון. האקסונים Reticulospinal מסומנים בכוכבית ירוקה. (ב) שיקום 3-D של סינפסה reticulospinal בחוט השדרה צמד ים מראה האקסון presynaptic reticulospinal עושה רב en קשר אגב (מסומנים בחצים ירוקים) אל הנוירון postsynaptic ^13. מסופי Presynaptic סומנו בתווית עם אלקסה פלואוריד 488 hydrazide phalloidin מצומדות (ירוק), בזמן שהנוירון postsynaptic כבר מלא בhydrazide אלקסה פלואוריד 568 (אדום).

האקסונים reticulospinal ענק צמד ים, הממוקמים באזור הגחון של מקביל בחוט השדרה לאיור 1 א ציר מקורי, זנב, מרובה טופס es קשר אגב הסינפטי על תאי עצב שלקרן השדרה הגחון ¹⁴ איור 1b ^13. כל תא מקרוסקופית זרמי Ca ^{2 +} נרשמו מהאקסונים reticulospinal בחוט השדרה שלם ^13,15. עם זאת, ניסיונות עיוורים קודמים במדידה ישירה של Ca ^{2 +} זרמים באקסונים reticulospinal בכבל צמד ים שלם השדרה באמצעות טכניקת מהדק תיקון מצורף תא הוכיחו לא מוצלחים ¹³ בשל חוסר הגישה לקרום הפנים שחרור סינפטי בשל תהליכי postsynaptic מתנגדים איור 1b. פני שחרור הקרום נעשה בעבר נגיש על ידי ההסרה של הנוירון postsynaptic ^11, ההפרעות מכאניות של סינפסה לפני הקלטת ¹² או טיפול אנזימטי בשילוב עם ניתוק מכאני ^16. בהתחשב בארגון המורכב של חוט השדרה, זה יהיה קשה מאוד להוכיח לזהות נוירון postsynaptic ולחזור בו באופן מכאני או להפריע הסינפסה דואר. לפיכך, החלטנו להשתמש בטיפול אנזימטי ¹⁷ אחרי ניתוק מכאני.

שימוש בגישה זו, פיתחנו הכנה בחריפות ניתקת של חוט השדרה צמד שמניב האקסונים reticulospinal מבודדים קיימא עם מסופי presynaptic פונקציונליים נטול כל תהליכי postsynaptic, ובכך לספק גישה חופשית למסופי presynaptic פרט. בשיתוף עם מיקרוסקופ רגיל הפוך ודימות פלואורסצנטי, זה מאפשר לנו לזהות ולמקד את מסופי presynaptic מזוהה fluorescently בודדים, עם טפטפת תיקון המכיל פתרון הקלטה שמבודד 4d איור 4C ואיור ^{2 +} זרמי Ca, להקלטה באמצעות תאי ד' טכניקת מתח מהדק מצורף. Ca ^{2 +} זרמים נרשמו ישירות בקרום הפנים שחרור presynaptic של 4F איור מסופי presynaptic פרט. זה significant פריצת הדרך בתחום של שידור סינפטי שכן הוא ההקלטה הראשונה מסוג זה בוצע בסינפסות מרכזיות.