ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

シナプス伝達は非常に迅速で正確なプロセスである。シナプス前終末の活動電位侵入は、シナプス前カルシウム結果として生じる増加、レリーズ顔膜に位置VGCCsの開口部につながる^{2 +}小胞融合および神経伝達物質の放出¹のトリガとして機能する。これらのステップのすべてがマイクロ秒^2、数百内で発生するため、小胞融合機構³にVGCCsの緊密な空間結合を必要とします。シナプス前のCa ^{2 +}フラックスは、主にカルシウム^{2 +}感受性色素^4を用いてアプローチ撮影により特徴付けられている。シナプス前ニューロン中のCa ^{2 +を}調節組み込むのCa ^{2 +}緩衝液は、間接的に、シナプス前カルシウムおよび神経伝達³との間の関係を特徴付けるために使用されている。また、カルシウム^{2 + 5}アンケージングまたはmacroscopiを記録することにより、シナプス前遊離Ca ^{2 +}濃度を調節することのCa ^{2 +} cの電流は小胞融合および/ ​​または放出の尺度と組み合わせて使用されている;そのような静電容量測定⁶または後シナプス応答と同じ問題に対処するために^2。しかし、カルシウムを直接解放面で^{2 +}電流、膜の脱分極は、シナプス小胞融合及び神経伝達物質の放出をトリガするのCa ^{2 +}電流に変換されるシナプス前膜の特殊なセクションを特徴付ける、カルシウムの正確な測定値を得るために不可欠な²⁺シナプス小胞の融合のための要件。また、直接小胞融合および放出の正確な同時測定と相まって個体シナプス前終末でのCa ^{2 +}電流を特徴付ける能力は、活動電位、シナプス前のCa ^{2 +}電流の時間的経過の間のタイミング関係の正確な解明を可能にし、小胞融合および放出。リリース面膜へのアクセスシナプス後樹状突起により並置を閉じるによるシナプス前末端の大部分では使用できません。それは個人のシナプス前終末での電流を直接測定を防ぐため、このアクセ​​ス不能にVGCCsの特性評価における主要な障害となっている。個別のシナプス前終末におけるシナプス前のCa ^{2 +}電流の直接の特徴付けは、これまで中枢シナプスでは不可能であった2つだけ腎杯型シナプス前終末に達成された。ニワトリ毛様体神経節^7-10およびラット腎杯^11,12の萼型シナプス。ヤツメウナギの脊髄¹³内の巨大な網様体シナプスを含む他のすべてのシナプス前終末では、シナプス前のリリースの顔膜へのアクセスの欠如は、シナプス前のCa ^{2 +}フラックスを研究するために、例えばCa ^{2 +}イメージングなどの間接的なアプローチの使用を必要としている。

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図1：ヤツメウナギ巨人網様体シナプス。（a）はヤツメウナギの脊髄の断面は背腹方向を示す。網様体軸索は緑のアスタリスクでマークされます。シナプス後ニューロン¹³の上に（緑色の矢印で示される）シナプス前網様体軸索パッサン接点EN数多くのことを示すヤツメウナギの脊髄における網様体シナプスの（b）の 3次元復元。シナプス後ニューロンがアレクサフルオロ568ヒドラジド（赤）で満たされているが、シナプス前終末には、アレクサフルオロ488ヒドラジド結合ファロイジン（緑色）で標識されている。

吻側-尾側軸を図1aに脊髄並列の腹側領域に位置ヤツメウナギ巨大な網様体軸索、ニューロン上にパッサンシナプスの連絡先専用のフォームに複数の脊髄前角¹⁴ 図1bは ^13。巨視的全細胞のCa ^{2 +}電流は、無傷の脊髄^13,15に網様体軸索から記録されています。しかし、Caを直接測定で前回のブラインドの試みは、細胞結合型パッチクランプ法を用いて、無傷のヤツメウナギの脊髄における網様体軸索内^{2 +}電流が原因の対向シナプス後のプロセスによるシナプス前のリリースの顔膜へのアクセスの欠如に¹³失敗したことが証明されている図1b。レリーズ顔膜は以前に、シナプスの機械的摂動前に^12を記録するか、機械的解離¹⁶と連結酵素処理にシナプス後ニューロン¹¹を除去することによってアクセス可能とされています。脊髄の複雑な組織を考慮すると、シナプス後ニューロンを識別し、機械的にそれを撤回または番目を撹乱することは極めて困難で証明する電子シナプス。したがって、私たちは機械的解離に続いて酵素処理^17を使用することにしました。

このアプローチを使用して、私たちはそれによって個人のシナプス前終末への無制限のアクセスを提供し、あらゆるシナプス後のプロセスを欠いた機能的なシナプス前終末で実行可能な孤立網様体の軸索が得ヤツメウナギの脊髄の急性解離準備を開発しました。標準の倒立顕微鏡と蛍光画像と一緒に、それが細胞-を使用して記録するためのCa ^{2 +}電流は図4c及び図4dに分離する記録液を含んだパッチピペットを用いて、同定および個別の蛍光同定シナプス前終末を標的にすることを可能添付の電圧クランプ法。のCa ^{2 +}電流は、個別のシナプス前終末図4fのシナプス前のリリース面膜に直接記録されている。これはsignificaですそれは中枢シナプスで実施された最初のこのような記録であるので、シナプス伝達の分野では画期的なヌクレオチド。