Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.
Astrositomların en yaygın ve agresif formu olan glioblastomalar, tedaviye refrakter ve moleküler olarak heterojendir. Ebeveyn tümörlerinin genomik profilini koruyan hücre kültürlerini, hastaya özgü in vitro ve in vivo modellerinde kullanılmak üzere oluşturabilme yeteneği, her tümörün moleküler özelliklerine göre uyarlanmış glioblastoma için yeni tedavilerin preklinik gelişiminde devrim yaratma potansiyeline sahiptir.
Tek hücrelere ayrışmış taze yüksek dereceli astrositoma tümörleri ile başlayarak, nörosfer testini, nöral kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu, uzun süreli kendini yenileme in vitrove ortotopik ksinograft tümörleri oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere kanser kök hücre fenotipini sunan hücreler için bir zenginleştirme yöntemi olarak kullanıyoruz. Bu yöntem daha önce önerildi ve şimdi birkaç araştırmacı tarafından kullanılıyor. 125 glioblastoma örneğini ayrıştırma ve kültleştirme deneyimimize dayanarak, burada sunduğumuz ayrıntılı protokole ulaştık, yüksek dereceli astrositomaların rutin nörosfer kültleme ve preklinik çalışmalar için tümörojenik hücrelerin büyük ölçekli genişlemesi için uygun. Bu protokolü kullanarak başarılı uzun vadeli kültürlerin verimliliği hakkında rapor veriyoruz ve nörosfer olarak büyümeyen ayrışmış glioblastoma hücrelerini kültleme için uygun fiyatlı alternatifler öneriyoruz. Ayrıca immünostokimya için nörosferler 3D mimarisini korumak için bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. GBM’lerin moleküler imzalarını ve heterojenliğini koruyan ortotopik ksinograft modelleri üretebilen CSC’lerde zenginleştirilmiş hücre kültürleri, GBM’lerin biyolojisinin incelenmesi ve potansiyel tedavilerin klinik öncesi testlerinin geliştirilmiş tasarımı için giderek daha popüler hale gelmektedir.
WHO sınıf IV astrositom olan Glioblastoma (GBM), en yaygın ve agresif primer beyin tümörüdür. Nöral kök hücre (NSC) belirteçlerinin ekspresyotiği, uzun süreli kendini yenileme ve astrositik belirteçleri ifade eden vetümörünbüyük kısmını oluşturan daha farklı hücrelere yol verme potansiyeli gibi “kanser kök hücresi” (CSC) özellikleri sergileyen hücreler de dahil olmak üzere gbm tümör hücreleri tarafından çeşitli gelişimsel fenotipler benimsenmiştir. KSS moleküler kimliği ve klinik etkileri ile ilgili açıklama hala gerekli olmakla birlikte, mevcut çalışmanın odak noktası KSS’nin operasyonel tanımıdır: uzun süreli kendini yenileme in vitro ve immün sistemi baskılanmış kemirgenlerde ortotopik implantasyon üzerine orijinal tümörü ayırt etme ve çoğaltma yeteneği.
Glioblastoma hücreleri on yıllardır% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren geleneksel ortamda kültürlenmiştir ve piyasada bulunan birkaç yüksek geçişli serum kültürlü GBM hücre hatları immün sistemi baskılanmış kemirgenlerde tümörijeniktir, ancak orijinal tümörden önemli genomik ve moleküler ayrışma vardır4, klinik olarak ilgili modeller olarak kullanımlarını sınırlar. Daha yakın zamanda, EGF ve bFGF’ye duyarlı kök/progenitör fenotipli hücreler GBM2’detanımlanmıştır. Daha sonra, ayrışmış GBM tümör örnekleri serumsuz bir ortamda kültürlendi3, başlangıçta nöral kök hücrelerin yetişkin memeli beyninden seçimi ve genişlemesi için formüleedilmiştir 5. Bu kültür koşulları, çoğu nonneoplastik ve daha farklı tümör hücre popülasyonlarının büyümesini engellerken, kök ve progenitör hücrelerin yüzen çok hücreli sferoidler veya nörosferler olarak büyümesini destekler3, yetişkin memeli nöral kök hücrelerin davranışını takliteder 5. Büyüme faktörleri (NMGF) ile desteklenmiş nörosfer ortamında veya %10 FBS ile desteklenmiş geleneksel büyüme ortamında kültürlenen birincil GBM hücrelerinin kapsamlı bir şekilde yan yana karşılaştırılması, GBM nörosferlerinin tümörojenik olduğunu, çok satırlı farklılaşma potansiyeli sunduğunu ve düşük pasajlarda tümörijenik olmayan ve geç pasajlarda orijinal tümörlerden önemli ölçüde ayrılan% 10 FBS kültürlerinin aksine orijinal tümörün genotipini koruduğunu ortaya koydu4.
CSC’nin, putatif CSC işaretleyici CD133’ün ifadesine dayanarak hücre sıralama yoluyla ayrışmış GBM tümörlerinden izole edilmesi de önerilmiştir6,7, ancak daha fazla çalışma, CSC fenotipinin bu tür belirteçlerin ifadesiyle kesin olarak ilişkili olmadığını gösterdi8-10, bu strateji için ilk hevesi azaltırken, yeni belirteçler hala test edilmektedir10. KSS’yi tanımlayan doğrulanmış bir işaretleyici kümesinin bugüne kadarki kullanılamaması, bu hücrelerin klinik öncesi çalışmalar için büyük ölçekli amplifikasyonu hedefiyle birlikte, hücre sıralamanın rutin CSC ile zenginleştirilmiş kültürler için pratik olmayan kullanımını işlemez hale getirir. NMGF’de nörosfer olarak büyüme yeteneği ile seçilen GBM hücreleri, sinirsel kök hücre belirteçlerini her zaman ifade eder. Sox2 ve nestin’in nörosfer kültürlerinde her yerde ifade edildiğini, CD133 proteininin ise GBM nörosferlerinin bir alt kümesinde bulunduğunu gözlemledik (yayınlanmamış veriler ve referans11).
Çeşitli laboratuvarlar, büyüme faktörleri 3 ,4,11-14ile desteklenmiş serumsuz ortamda aynı genel enzmatikayrışma ve kültleme yaklaşımını kullanarak glioblastoma tümörlerinden nörosfer kültürlerini takipederken,diğer meslektaşları gbm örneklerinden uzun vadeli nörosfer kültürlerini başarı olmadan büyütme girişimleri bildirmektedir. Burada sunulan yüksek dereceli gliomaların enzmatik ayrışması ve nörosfer kültürü için genel yöntem, yukarıdaki yayınlarda özetlenenlere benzer. Protokolü, 100 GBM’den fazla numuneyi ayrıştırma ve kültleştirme deneyimimize dayanarak optimize ettik. Burada sunulan protokolü uygulayan taze GBM örneklerinden uzun vadeli nörosfer kültürleri elde etmenin verimliliği% 40’ın üzerindedir, verimlilik verilerini gösteren birkaç raporabenzer3,15, EGF ve bFGF’nin ECMproteini 16ile kaplanmış yüzeylerde monolayer olarak serum içermeyen ortamda sürekli veya aralıklı olarak hücrelerin kültleşmesi gibi alternatif protokollerin araştırılmasına yol açmaktadır. Nörosfer kültürleri hala GBM tümörlerinin moleküler özelliklerini ve tümörijenik potansiyeli korumak için en doğrulanmış ve giderek daha popüler bir yaklaşımdır3,4,11-14, bu nedenle yaklaşımımız önce nörosfer kültürlerini denemektir, hayvan modellerinde kullanılabilecek GBM tümörlerinin temsilini artırmak için uzun süreli kendi kendini yenileyen nörosferler oluşturamayan GBM hücrelerini kültleme için alternatif yöntemleri birlikte test ederken ( Şekil1). Burada GBM’lerden nörosferleri kültleme protokolü sunuyoruz. Nörosfer oluşturamayan hücreler için, büyüme ortamında basit bir değişiklik gösteriyoruz, çünkü tümörosfer olmayan hücrelerden GBM’ler oluşturan, umut verici sonuçlar veren ve hala kapsamlı doğrulamadan geçen ilk girişim olarak basit bir değişiklik gösteriyoruz.
Uygun enzymatik tümör hücresi ayrışması bu protokolde kritik bir adımdır. Doku, 37 °C’de hücre ayrıştırma çözeltisinde inkübasyondan önce, en az 30 dakika boyunca, dokunun mekanik olarak üçe alınması ve ayrışma uzantısının doğrulanması gerektiğinde iyice kıyılmalıdır. Doku uyum derecesine bağlı olarak, kuluçka, tek hücrelere ayrışma işlemini tamamlamak için gerektiğinde 15-30 dakika daha uzatılabilir. Hücre canlılığının azalması nedeniyle 1 saatten uzun süre ayrışma çözümünde inkübasyon önerilmez. Optimal başlangıç dokusu miktarı 200-500 mg olmasına rağmen, bu protokol 50 mg kadar az tümör dokusundan başarılı nörosfer kültürlerine yol açmıştır.
Serumsuz NMGF seçici bir ortamdır ve tümörün büyük kısmını oluşturan neoplastik hücrelerin bir yüzdesi ve konak hücreler hayatta kalamazken, diğerleri kaplamadan sonra tedavi edilen şişeye bağlanacaktır. 1-3 hafta boyunca oluşacak nörosferlerin (Şekil 1B-E) farklılaşmış tümör hücrelerinden ve döküntülerinden ayrılmak için taze şişelere aktarılması kritik öneme sahiptir.
GBM hücreleri enzimmatik olarak ayrışır ve hiçbir zaman kültüre edilmez (adım 1.10), nörosfer kültürünün başarısız olması durumunda, alternatif medyada kültüre hücrelerin yedek kaynağı olarak kriyoprezer olarak saklanabilir. Bu tür donmuş stoklardan nörosfer kültürlerinin yanı sıra% 2 FBS / NMGF’de büyüyen monolayer hücrelerden başarıyla elde ettik.
Kavramsal olarak, “kanser kök hücresi” devam eden bir çalışmadır ve bu gelişmekte olan alan ek açıklamalardan yararlanacaktır, çünkü klinik etkileri, özellikle tümör heterojenliği, plastisite ve tedaviye direnç oluşturmada önemli ölçüde19,20. Nörosfer kültürleri, hastaya özgü GBM hayvan modelleri üretmek için hayati öneme sahip olmasının yanı sıra, büyüme faktörlerine yanıt olarak hücre sinyalizasyonunda değişiklik ve gen ekspresyonu, hipoksi ve farmakolojik ajanlar11,21gibi in vitro çalışmalar için de değerlidir. Tüm küreyi etiketleme ve görüntülemenin daha yaygın yöntemi ile ilgili üstün hücre altı lokalizasyonu nedeniyle, immünofizyömi11tarafından protein ekspresyasyonu ve çeviri sonrası modifikasyonları incelemek için 3D mimariyi koruyarak formalin sabit ve parafin gömülü nörosferlerin kesitlerini kullanmayı tercih ettik.
Yetişkin memeli beyninden elde edilen nörosferlerdeki tüm hücrelerin kök hücre olmadığı gösterilmiştir22. Benzer şekilde, GBM tümörlerinden kültürlenen nörosferler, daha farklı kanser progenitör hücrelerinin varlığı ve yüksek hücre yoğunluklarında ortaya çıktığı bilinen kendi kendine toplama nedeniyle klonal değildir23Bu yöntemin bazıları tarafından bir sınırlaması olarak kabul edilir. Nörosferler22olarak geçici olarak büyüyebilen sadece progenitörlerin aksine, uzun süreli kendi kendini yenileyen kök hücreler için zenginleşmeyi tercih etmek için, birincil nörosferler ikincil nörosfer oluşumu için ayrışır ve kök hücrelerde zenginleştirilmiş bir popülasyonun göstergesi olan sürekli kültürde kabaca 2 aya eşdeğer en az 10 pasaj için daha fazla geçiş yapılır22. Deneyimlerimize göre, bu işareti elde eden GBM nörosfer kültürleri süresiz olarak nörosfer olarak genişletilmeye devam edebilir. Tümör derecesi önemlidir, çünkü sırasıyla GBM’lerden ve anaplastik astrositomalardan, WHO sınıf IV ve III’ten başarılı kültürler elde ettik, ancak alt dereceli gliomalardan elde etmedik.
Glioblastoma hücrelerini kültlemenin en yaygın yöntemi, % 10 FBS ile desteklenmiş geleneksel büyüme ortamında, orijinal tümörlerden önemli genomik ve fenotipik ayrışmaya yol açar 4. Öte yandan, nörosfer kültürleri kanser kök hücre fenotipi4sunan kararlı ve uzun vadeli bir hücre kaynağıdır. Nörosfer yöntemi, bu yöntemin ana zayıflığını temsil eden tüm yüksek dereceli astrositom örnekleri için başarılı olmamasına rağmen, ortotopik fare ksinograft modelleri için uzun vadeli kültürlerde CSC’nin zenginleştirilmesi için giderek daha popüler hale gelmiştir. Ebeveyn tümörlerinin moleküler özelliklerinin nörosfer oluşumunu nasıl etkileyebileceğini anlamaya yönelik çalışmalar devam etmektedir. “Omics” bilgilerinin erişilebilirliği ve potansiyel hedefli tedavilerin sayısının artmasıyla beslenen kişiselleştirilmiş tıp çağına ilerlerken, hastaya özgü GBM modellerine sahip olmanın önemli avantajları göz önüne alındığında, kültür yüksek dereceli gliomalara pratik alternatif yöntemlerin araştırılması ve ardından kapsamlı doğrulama verilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Hermelin Beyin Tümörü Merkezi, Henry Ford Hastanesi tarafından finanse edilmiştir.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |