Протокол для распространения диссоциированных высококачественных глиомы хирургических образцов в сыворотке свободной нейросферы среды для выбора для клеток с фенотипом стволовых клеток рака. Для образцов, которые не растут как нейросферы, предлагается альтернативный протокол. Описана парафиновая техника встраивания для поддержания 3D нейросферной архитектуры иммуноцитохимии.
Глиобластомы, наиболее распространенная и агрессивная форма астроцитомы, огнеупорны к терапии и молекулярно неоднородны. Способность создавать клеточные культуры, которые сохраняют геномный профиль родительских опухолей, для использования в конкретных моделях in vitro и in vivo пациента, имеет потенциал, чтобы революционизировать доклинческое развитие новых методов лечения глиобластомы с учетом молекулярных характеристик каждой опухоли.
Начиная со свежих высококачественных опухолей астроцитомы, разобщенных на одиночные клетки, мы используем нейросферный анализ в качестве метода обогащения клеток, представляя фенотип раковых стволовых клеток, включая экспрессию маркеров нервных стволовых клеток, долгосрочное самообувечивание in vitroи способность формировать ортопедические опухоли ксенотрансплантата. Этот метод был ранее предложен, и в настоящее время используется несколькими следователями. Основываясь на нашем опыте диссоциации и культивирования 125 образцов глиобластомы, мы пришли к подробному протоколу, который мы представляем здесь, подходящему для рутинного культивирования нейросферы высокосортных астроцитом и крупномасштабного расширения опухолевых клеток для доклиничных исследований. Мы сообщаем об эффективности успешных долгосрочных культур, использующих этот протокол, и предлагаем доступные альтернативы для культивирования диссоциированных клеток глиобластомы, которые не могут расти как нейросферы. Мы также подробно описываем протокол сохранения 3D-архитектуры нейросферы для иммуногистохимии. Клеточные культуры, обогащенные ЦСЗ, способные генерировать ортопедические модели ксенотрансплантата, которые сохраняют молекулярные подписи и неоднородность ГБМ, становятся все более популярными для изучения биологии ГБМ и для усовершенствования дизайна доклинкативного тестирования потенциальных методов лечения.
Глиобластома (ГБМ), астроцитома IV степени ВОЗ, является наиболее распространенной и агрессивной первичной опухолью мозга. Разнообразные фенотипы развития принимаются опухолевыми клетками ГБМ, включая клетки, экспонирующие характеристики «раковых стволовых клеток» (CSC), такие как экспрессия маркеров нервной стволовой клетки (NSC), долгосрочное самообувещение и потенциал, чтобы привести к более дифференцированным клеткам, выражаюющим астроцитные маркеры и образующим основнуючасть опухоли 1-3. Хотя еще необходимо разъяснение в отношении молекулярной идентичности CSC и клинических последствий, основное внимание в настоящее время работы уделяется оперативному определению CSC: долгосрочное самообувещение in vitro и способность дифференцировать и воспроизвести исходную опухоль при ортопедической имплантации у грызунов с ослабленным иммунитетом.
Клетки глиобластомы были культурны в течение десятилетий в традиционной среде, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и несколько высоких проходов коммерчески доступны сыворотки культурных линий клеток GBM являются опухолевые у ослабленных иммунитетом грызунов, но есть значительное геномное и молекулярное расхождение отпервоначальной опухоли 4, ограничивая их использование в качестве клинически значимых моделей. Совсем недавно, клетки со стеблем / прародителем фенотип реагировать на EGF и bFGF были определены в GBMs2. Впоследствии, диссоциированные образцы опухоли GBM были обучены в безотхвочнойсреде 3, первоначально сформулированной для отбора и расширения нервных стволовых клеток из мозга взрослогомлекопитающего 5. Эти культурные условия препятствуют росту большинства ненеопластических и более дифференцированных популяций опухолевых клеток, в то время как в пользу роста стволовых клеток и клеток-предшественников, как плавающие многоклеточные сфероиды,или нейросферы 3, имитируя поведение взрослых млекопитающих нервных стволовыхклеток 5. Всеобъемлющее бок о бок сравнение первичных клеток ГБМ, культурных либо в нейросферной среде, дополненной факторами роста (NMGF), либо в традиционной среде роста, дополненной 10% FBS, выяснилось, что нейросферы ГБМ были опухолевые, представлены многолинейные дифференциации потенциал, и сохранили генотип оригинальной опухоли, в отличие от 10% FBS культур, которые не были опухолевые на низких проходах и значительно отличается от первоначальных опухолей в концепроходов 4.
Изоляция CSC от диссоциированных опухолей GBM путем сортировки клеток на основе выражения мяукотного маркера CSC CD133 такжебыла предложена 6,7 , нодальнейшаяработа показала, что фенотип CSC не окончательно связан свыражением таких маркеров 8-10, уменьшая первоначальный энтузиазм к этой стратегии, в то время как новые маркеры все еще тестируются10. Отсутствие на сегодняшний день проверенного набора маркеров, определяющих CSC, наряду с целью крупномасштабного усиления этих клеток для доклиновой исследования, делает использование сортировки клеток нецелесообразным для обычных культур, обогащенных CSC. КЛЕТКИ GBM выбранные способностью вырасти как нейросферы в NMGF неизменно выражают нервные маркеры стволовой клетки. Мы заметили, что Sox2 и nestin повсеместно выражены в нейросферных культурах, в то время как белок CD133 присутствует в подмножестве нейросфер GBM (неопубликованные данные иссылка 11).
Несколько лабораторий проводят нейросферных культур из опухолей глиобластомы, используя тот же общий подход энзиматической диссоциации и культивирования в сыворотке свободной среде дополненыфакторами роста 3,4,11-14, в то время как другие коллеги сообщили о попытках расти долгосрочные культуры нейросферы из образцов GBM безуспешно. Общий метод энзиматической диссоциации и нейросферной культуры глиом высокого класса, представленный здесь, аналогичен тому, что было изложено в вышеуказанных публикациях. Мы оптимизировали протокол на основе нашего опыта разобщения и культивирования более 100 образцов GBM. Эффективность получения долгосрочных нейросферных культур из свежих образцов GBM, применяющих представленный здесь протокол, составляет более 40%, что похоже на несколько отчетов, показывающихданные об эффективности 3,15,что приводит к исследованию альтернативных протоколов, таких как культивирование клеток постоянно или с перерывами в безотхвочной среде в присутствии EGF и bFGF в качестве монослой на поверхностях, покрытых ECM-белком16,17. Нейросферные культуры по-прежнему являются наиболее проверенным и все более популярным подходом к сохранению ГБМ опухолевых молекулярных характеристик и опухолевыхпотенциал 3,4,11-14, таким образом, наш подход заключается в попытке нейросферных культур во-первых, в то время как сопутствующие тестирования альтернативных методов для культивирования GBM клеток, которые не в состоянии сформировать долгосрочные самообновляющиеся нейросферы (Рисунок 1), чтобы увеличить представление опухолей GBM, которые могут быть использованы в животных моделях. Здесь мы представляем протокол для культивирования нейросфер от ГБМ. Для клеток, которые не образуют нейросферы, мы показываем простую модификацию в среде роста, как первая попытка культуры опухолевых клеток из ненейросферы формирования ГБМ, с многообещающими результатами и до сих пор проходит обширную проверку.
Правильная энзиматическая диссоциация опухолевых клеток является критическим шагом в этом протоколе. Ткань должна быть измельчена задолго до инкубации в растворе диссоциации клеток при 37 градусов по Цельсию при вращении, в течение как минимум 30 минут, когда ткань должна быть механически тритурирована и проверено расширение диссоциации. В зависимости от степени сплоченности тканей, инкубация может быть продлена еще на 15-30 мин, по мере необходимости для завершения диссоциации в одиночные клетки. Инкубация в растворе диссоциации более 1 часа не рекомендуется из-за снижения жизнеспособности клеток. Хотя оптимальное количество стартовой ткани составляет 200-500 мг, этот протокол привел к успешной нейросферы культур всего от 50 мг опухолевой ткани.
Сыворотка свободной NMGF является селективной среде, и процент неопластических клеток, включающих основную часть опухоли, а также принимающих клеток, не выживет, в то время как другие будут прикрепляться к культуре тканей лечение колбы после покрытия. Очень важно, чтобы нейросферы, которые будут образовываться в течение 1-3 недель(рисунки 1B-E) передаются в свежие колбы, чтобы отделить от дифференцированных опухолевых клеток и мусора.
Клетки GBM enzymatically dissociated и никогда не культурные (шаг 1.10) можно криоконсервированы как подпорной источник клеток к культуре в альтернативных средствах массовой информации, в случае, если нейросферная культура терпит неудачу. Мы успешно получили нейросферные культуры из таких замороженных запасов, а также монослойные клетки, растущие в 2% FBS/NMGF.
Концептуально, “раковая стволовая клетка” является работа, и эта новая область выиграют от дополнительных разъяснений, так как клинические последствия являются значительными, особенно в генерации неоднородности опухоли, пластичность, и устойчивость ктерапии 19,20. В дополнение к жизненно важному для генерации конкретных пациентов GBM животных моделей, нейросферных культур также ценны для исследований in vitro, таких как изменение в клеточной сигнализации и экспрессии генов в ответ на факторы роста, гипоксия, и фармакологическиеагенты 11,21. Мы выбрали для использования поперечных сечений формалина фиксированной и парафин встроенных нейросфер, сохраняя 3D архитектуры, для изучения экспрессии белка и пост-трансляционных модификаций иммуногистохимии11, в связи с превосходной субклеточной локализации по отношению к более распространенному методу маркировки и визуализации всей сферы.
Было показано, что не все клетки в нейросферах, полученных из мозга взрослых млекопитающих являются стволовымиклетками 22. Аналогичным образом, нейросферы, вырастаемые из опухолей ГБМ, скорее всего, не клональные, из-за наличия более дифференцированных клеток-предшественников рака и самоагрегации, как известно, происходят привысокой плотности клеток 23, что считается ограничением этого метода некоторыми. В пользу обогащения для долгосрочного самообновляющиеся стволовые клетки, в отличие от только прародителей, которые могут временно расти какнейросферы 22, первичные нейросферы разобщены для вторичного формирования нейросферы, и далее пролетали в течение как минимум 10 проходов, примерно эквивалентно 2 месяцев в непрерывной культуре, что является признаком популяции, обогащеннойстволовыми клетками 22. По нашему опыту, GBM нейросферных культур, которые достигают этой отметки может продолжать расширяться как нейросферы на неопределенный срок. Оценка опухолей имеет значение, так как мы получили успешные культуры от ГБМ и анапластических астроцитом, IV и III классов ВОЗ, соответственно, но не от глиом более низкого класса.
Наиболее распространенный метод культивирования клеток глиобластомы, в традиционной среде роста, дополненной 10% FBS, приводит к значительному геному и фенотипической дивергенции от оригинальных опухолей 4. С другой стороны, нейросферные культуры являются стабильным и долгосрочным источником клеток, представляя фенотип стволовых клетокрака 4. Нейросферный метод становится все более популярным для обогащения CSC в долгосрочных культурах для ортопедических моделей ксенотрансплантата мыши, несмотря на то, что не был успешным для всех образцов астроцитомы высокого класса, что представляет собой главную слабость этого метода. Исследования, чтобы понять, как молекулярные характеристики родительских опухолей могут повлиять на формирование нейросферы ведутся. Изучение практических альтернативных методов культуры высокого класса глиомы, а затем обширная проверка предоставляется, учитывая важные преимущества наличия пациента конкретных моделей ГБМ, как мы заранее в эпоху персонализированной медицины, подпитывается доступность “омич” информации и увеличение числа потенциальных целевых методов лечения.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована Центром опухолей головного мозга Гермелина, больницей Генри Форда.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |