Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l’architettura della neurosfera 3D per l’immunocitochimica.
I glioblastomi, la forma più comune e aggressiva di astrocitoma, sono refrattari alla terapia e molecolarmente eterogenei. La capacità di stabilire colture cellulari che preservano il profilo genomico dei tumori parentali, da utilizzare in modelli specifici per pazienti in vitro e in vivo, ha il potenziale per rivoluzionare lo sviluppo preclinico di nuovi trattamenti per il glioblastoma su misura per le caratteristiche molecolari di ogni tumore.
A partire da nuovi tumori dell’astrocitoma di alto grado dissociati in singole cellule, usiamo il saggio della neurosfera come metodo di arricchimento per le cellule che presentano fenotipo delle cellule staminali tumorali, compresa l’espressione di marcatori di cellule staminali neurali, l’autorinnoto a lungo termine in vitroe la capacità di formare tumori xenograft ortotopici. Questo metodo è stato precedentemente proposto ed è ora in uso da diversi investigatori. Sulla base della nostra esperienza di dissociazione e coltivazione di 125 esemplari di glioblastoma, siamo arrivati al protocollo dettagliato che presentiamo qui, adatto per la ristrutturazione di routine della neurosfera di astrocitomi di alto grado e l’espansione su larga scala di cellule tumorali per studi preclinici. Riferiamo sull’efficienza delle colture di successo a lungo termine utilizzando questo protocollo e suggeriamo alternative convenienti per coltivare cellule di glioblastoma dissociate che non riescono a crescere come neurosfere. Descriviamo inoltre in dettaglio un protocollo per preservare l’architettura 3D delle neurosfere per l’immunoistochimica. Le colture cellulari arricchite in CSC, in grado di generare modelli di xenograft ortotopici che preservano le firme molecolari e l’eterogeneità dei GBM, stanno diventando sempre più popolari per lo studio della biologia dei GBM e per il miglioramento della progettazione di test preclinici di potenziali terapie.
Il glioblastoma (GBM), un astrocitoma di IV grado dell’OMS, è il tumore al cervello primario più diffuso e aggressivo. Diversi fenotipi dello sviluppo sono adottati dalle cellule tumorali GBM, comprese le cellule che presentano caratteristiche di “cellule staminali tumorali” (CSC), come l’espressione di marcatori di cellule staminali neurali (NSC), l’autorinnoto a lungo termine e il potenziale di dare origine a cellule più differenziate che esprimono marcatori astrocitici e formano la maggior parte del tumore1-3. Sebbene sia ancora necessario chiarire l’identità molecolare del CSC e le implicazioni cliniche, il lavoro attuale si concentra sulla definizione operativa del CSC: autorinoto a lungo termine in vitro e capacità di differenziare e riprodurre il tumore originale su impianto ortotopico nei roditori immunocompro compromessi.
Le cellule di glioblastoma sono state coltivate per decenni in mezzo tradizionale contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e diverse linee cellulari GBM coltivate a siero ad alto passaggio disponibili in commercio sono cancerogene nei roditori immunocompromanti, ma c’è una notevole divergenza genomica e molecolare rispetto al tumoreoriginale 4,limitandone l’uso come modelli clinicamente rilevanti. Più recentemente, le cellule con fenotipo staminali/progenitore reattive all’EGF e bFGF sono state identificate nei GBM2. Successivamente, campioni di tumore GBM dissociati sono stati coltivati in un mezzo 3 privo di siero, originariamente formulato per la selezione el’espansionedelle cellule staminali neurali dal cervello di mammiferi adulti5. Queste condizioni di coltura ostacolano la crescita della maggior parte delle popolazioni di cellule tumorali non neoplastiche e differenziate, favorendo al contempo la crescita delle cellule staminali e progenitrici come sferoidi multicellulari galleggianti, o neurosfere3, imitando il comportamento delle cellule staminali neurali dei mammiferi adulti5. Il confronto completo fianco a fianco delle cellule primarie GBM coltivate in mezzo alla neurosfera integrato con fattori di crescita (NMGF) o nel mezzo di crescita tradizionale integrato con FBS al 10%, ha rivelato che le neurosfere GBM erano cancerogene, presentavano un potenziale di differenziazione multilinea e preservavano il genotipo del tumore originale, in contrasto con le colture FBS al 10% che non erano tumorigeniche a passaggi bassi e si differenziavano considerevolmente dai tumori originali ai passaggi4.
L’isolamento del CSC dai tumori GBM dissociati mediante smistamento cellulare basato sull’espressione del marcatore CSC putativo CD133 è stato propostoanche 6,7, ma ulteriori lavori hanno indicato che il fenotipo CSC non è definitivamente associato all’espressionedi tali marcatori 8-10, diminuendo l’entusiasmo iniziale per questa strategia, mentre nuovi marcatori sono ancora in fase di test10. L’indisponibilità fino ad oggi di un insieme convalidato di marcatori che definiscono il CSC, insieme all’obiettivo di amplificazione su larga scala di queste cellule per studi preclinici, rende impraticabile l’uso dello smistamento cellulare per colture arricchite da CSC di routine. Le cellule GBM selezionate dalla capacità di crescere come neurosfere nel NMGF esprimono invariabilmente marcatori di cellule staminali neurali. Abbiamo osservato che sox2 e nenina sono onnipresentemente espressi nelle colture della neurosfera, mentre la proteina CD133 è presente in un sottoinsieme delle neurosfere GBM (dati inediti e riferimento11).
Diversi laboratori stanno perseguendo colture di neurosfera da tumori del glioblastoma utilizzando lo stesso approccio generale di dissociazione enzimatica e coltura in mezzo privo di siero integrato confattori di crescita 3,4,11-14, mentre altri colleghi hanno segnalato tentativi di far crescere colture di neurosfera a lungo termine da campioni GBM senza successo . Il metodo generale per la dissociazione enzimatica e la cultura della neurosfera dei gliomi di alta qualità qui presentati è simile a quello delineato nelle pubblicazioni di cui sopra. Abbiamo ottimizzato il protocollo in base alla nostra esperienza di dissociazione e coltivazione di oltre 100 campioni GBM. L’efficienza di ottenere colture di neurosfera a lungo termine da campioni gbm freschi applicando il protocollo qui presentato è superiore al 40%, simile ai pochi rapporti che mostrano dati diefficienza 3,15,portando all’esplorazione di protocolli alternativi come la coltivazione continua o intermittente di cellule in mezzo privo di siero in presenza di EGF e bFGF come monostrati su superfici rivestite con proteina ECM16,17. Le colture della neurosfera sono ancora l’approccio più convalidato e sempre più popolare per preservare le caratteristiche molecolari dei tumori GBM e il potenziale tumorigenico3,4,11-14, quindi il nostro approccio è quello di tentare prima le colture di neurosfere, mentre testa concomitante metodi alternativi per coltivare cellule GBM che non riescono a formare neurosfere autoreno rinnovarsi a lungo termine ( Figura 1 ), per aumentare larappresentazionedei tumori GBM che possono essere utilizzati nei modelli animali. Qui presentiamo un protocollo per la coltivatorie delle neurosfere dai GBM. Per le cellule che non riescono a formare neurosfere, mostriamo una semplice modifica nel mezzo di crescita, come primo tentativo di coltura di cellule tumorigeniche da nonneurosfera formando GBM, con risultati promettenti e ancora in fase di ampia convalida.
Una corretta dissociazione enzimatica delle cellule tumorali è un passo critico in questo protocollo. Il tessuto deve essere tritato ben prima dell’incubazione in soluzione di dissociazione cellulare a 37 °C in rotazione, per un minimo di 30 minuti, quando il tessuto deve essere triturato meccanicamente e l’estensione della dissociazione verificata. A seconda del grado di coesione tissutale, l’incubazione può essere estesa per ulteriori 15-30 minuti, se necessario per completare la dissociazione in singole cellule. L’incubazione in soluzione di dissociazione per più di 1 ora non è raccomandata a causa della diminuzione della vitalità cellulare. Sebbene la quantità ottimale di tessuto iniziale sia di 200-500 mg, questo protocollo ha portato a colture di neurosfera di successo da appena 50 mg di tessuto tumorale.
L’NMGF privo di siero è un mezzo selettivo e una percentuale di cellule neoplastiche che comprendono la maggior parte del tumore, così come le cellule ospiti, non sopravviverà, mentre altre si attaccheranno al pallone trattato con coltura tissutale dopo la placcatura. È fondamentale che le neurosfere che si formeranno nell’corso di 1-3 settimane (Figure 1B-E) siano trasferite a fiasche fresche, per separarsi da cellule tumorali differenziate e detriti.
Le cellule GBM enzimaticamente dissociate e mai coltivate (fase 1.10) possono essere crioconservate come fonte di backup di cellule da coltura in mezzi alternativi, nel caso in cui la coltura della neurosfera fallisca. Abbiamo ottenuto con successo colture di neurosfera da tali stock congelati, così come cellule monostrato che crescono nel 2% FBS / NMGF.
Concettualmente, “cellula staminale tumorale” è un lavoro in corso e questo campo emergente beneficerà di ulteriori chiarimenti, poiché le implicazioni cliniche sono considerevoli, in particolare nella generazione di eterogeneità tumorale, plasticità e resistenza alla terapia19,20. Oltre ad essere vitali per generare modelli animali GBM specifici del paziente, le colture della neurosfera sono preziose anche per studi in vitro come l’alterazione della segnalazione cellulare e l’espressione genica in risposta a fattori di crescita, ipossia e agentifarmacologici 11,21. Abbiamo optato per l’utilizzo di sezioni trasversali di neurosfere fisse e paraffina incorporate, preservando l’architettura 3D, per studiare l’espressione proteica e le modifiche post-trascilizionali mediante immunoistochimica11,grazie alla localizzazione subcellulare superiore in relazione al metodo più comune di etichettatura e imaging dell’intera sfera.
È stato dimostrato che non tutte le cellule all’interno delle neurosfere derivate dal cervello adulto dei mammiferi sono cellule staminali22. Allo stesso modo, le neurosfere coltivate da tumori GBM probabilmente non clonali, a causa della presenza di cellule progenitrici tumorali più differenziate e dell’auto-aggregazione, nota per verificarsi ad alte densitàcellulari 23, che è considerata una limitazione di questo metodo da parte di alcuni. Per favorire l’arricchimento per cellule staminali autoreno rinnovarsi a lungo termine, al contrario dei soli progenitori che possono crescere transitoriamente come neurosfere22, le neurosfere primarie sono dissociate per la formazione della neurosfera secondaria e ulteriormente passageate per un minimo di 10 passaggi, approssimativamente equivalenti a 2 mesi in coltura continua, che è un’indicazione di una popolazione arricchita in cellule staminali22. Nella nostra esperienza, le culture della neurosfera GBM che raggiungono questo marchio possono continuare ad essere espanse come neurosfere indefinitamente. Il grado tumorale è importante, dal momento che abbiamo ottenuto culture di successo da GBM e astrocitomi anaplastici, rispettivamente di grado IV e III dell’OMS, ma non da gliomi di grado inferiore.
Il metodo più prevalente di coltura delle cellule del glioblastoma, nel mezzo di crescita tradizionale integrato con FBS al 10%, porta a notevoli divergenze genomiche e fenotipiche rispetto ai tumori originali 4. D’altra parte, le colture della neurosfera sono una fonte stabile e a lungo termine di cellule che presentano fenotipo 4 delle cellulestaminali tumorali. Il metodo della neurosfera è diventato sempre più popolare per l’arricchimento del CSC in colture a lungo termine per modelli di xenograft di topo ortotopico, nonostante non abbia avuto successo per tutti i campioni di astrocitoma di alto grado, che rappresenta la principale debolezza di questo metodo. Sono in corso studi per capire come le caratteristiche molecolari dei tumori parentali possano influenzare la formazione della neurosfera. Viene concessa l’esplorazione di metodi alternativi pratici alla cultura di gliomi di alto livello, seguiti da un’ampia convalida, dati i vantaggi epocali di avere modelli GBM specifici per il paziente, mentre avanziamo in un’era di medicina personalizzata, alimentata dall’accessibilità di informazioni “omiche” e dall’aumento del numero di potenziali terapie mirate.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dall’Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |