Protokoll zur Verbreitung von dissoziierten hochgradigen chirurgischen Gliomproben im serumfreien Neurosphärenmedium zur Auswahl für Zellen mit Krebsstammzellphänotyp. Für Proben, die nicht als Neurosphären wachsen, wird ein alternatives Protokoll vorgeschlagen. Eine Paraffin-Einbettungstechnik zur Aufrechterhaltung der 3D-Neurosphärenarchitektur für die Immunzytochemie wird beschrieben.
Glioblastome, die häufigste und aggressivste Form des Astrozytom, sind feuerfest bis zur Therapie und molekular heterogen. Die Fähigkeit, Zellkulturen zu etablieren, die das genomische Profil der elterlichen Tumoren erhalten, für den Einsatz in patientenspezifischen In-vitro- und In-vivo-Modellen, hat das Potenzial, die präklinische Entwicklung neuer Behandlungen für Glioblastom zu revolutionieren, die auf die molekularen Eigenschaften jedes Tumors zugeschnitten sind.
Beginnend mit frischen hochgradigen Astrozytom-Tumoren, die in Einzelzellen dissoziiert sind, verwenden wir den Neurosphären-Assay als Anreicherungsmethode für Zellen, die Krebsstammzell-Phänotyp darstellen, einschließlich der Expression von neuronalen Stammzellmarkern, der langfristigen Selbsterneuerung in vitround der Fähigkeit, orthotopische Xenograft-Tumoren zu bilden. Diese Methode wurde bereits vorgeschlagen und wird nun von mehreren Ermittlern angewandt. Basierend auf unserer Erfahrung der Dissoziierung und Kultivierung von 125 Glioblastom-Proben gelangten wir zu dem detaillierten Protokoll, das wir hier vorstellen, geeignet für die routinemäßige Neurosphärenkultivierung von hochgradigen Astrozymen und eine großflächige Expansion tumorigener Zellen für präklinische Studien. Wir berichten über die Effizienz erfolgreicher Langzeitkulturen mit diesem Protokoll und schlagen erschwingliche Alternativen für die Kultivierung dissoziierter Glioblastomzellen vor, die nicht als Neurosphären wachsen. Wir beschreiben auch im Detail ein Protokoll zur Erhaltung der Neurosphären 3D-Architektur für die Immunhistochemie. Zellkulturen, die in CSCs angereichert sind und in der Lage sind, orthotopische Xenograft-Modelle zu erzeugen, die die molekularen Signaturen und die Heterogenität von GBMs bewahren, werden immer beliebter für das Studium der Biologie von GBMs und für die verbesserte Gestaltung präklinischer Tests potenzieller Therapien.
Glioblastom (GBM), ein Astrozytom des WHO-Grades IV, ist der am weitesten verbreitete und aggressivste primäre Hirntumor. Verschiedene Entwicklungsphänotypen werden von GBM-Tumorzellen übernommen, einschließlich Zellen, die “Krebsstammzell”-Eigenschaften (CSC) aufweisen, wie die Expression von neuronalen Stammzellmarkern (NSC), langfristige Selbsterneuerung und das Potenzial, differenziertere Zellen hervorrufen zu können, die astrozytische Marker exzieren und den Großteil des Tumors1-3bilden. Während noch Klärungsbedarf in Bezug auf die molekulare Identität von CSC und die klinischen Implikationen besteht, liegt der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der operativen Definition von CSC: langfristige Selbsterneuerung in vitro und die Fähigkeit, den ursprünglichen Tumor bei orthotopischer Implantation bei immungeschwächten Nagetieren zu differenzieren und zu reproduzieren.
Glioblastom-Zellen werden seit Jahrzehnten in traditionellen Medien kultiviert, die 10% fetales Rinderserum (FBS) und mehrere hochdurchlässige kommerziell erhältliche serumkultivierte GBM-Zelllinien bei immungeschwächten Nagetieren tumorigene, aber es gibt eine erhebliche genomische und molekulare Divergenz vom ursprünglichen Tumor4, die ihre Verwendung als klinisch relevante Modelle einschränken. In jüngerer Zeit wurden In GBMs2Zellen mit Stamm-/Vorläufer-Phänotyp identifiziert, die auf EGF und bFGF reagieren. Anschließend wurden dissoziierte GBM-Tumorproben in einem serumfreien Medium3kultiviert, ursprünglich für die Auswahl und Erweiterung neuronaler Stammzellen aus dem erwachsenen Säugetierhirnformuliert 5. Diese Kulturbedingungen behindern das Wachstum der meisten nichtneoplastischen und differenzierteren Tumorzellpopulationen, während sie das Wachstum von Stamm- und Vorläuferzellen als schwimmende mehrzellige Sphäroide oder Neurosphären3bevorzugen, die das Verhalten von adulten neuronalen Stammzellen imitieren5. Umfassender Vergleich der primären GBM-Zellen, die entweder in Neurosphärenmedium kultiviert werden, ergänzt durch Wachstumsfaktoren (NMGF) oder im traditionellen Wachstumsmedium, ergänzt durch 10% FBS, zeigte, dass die GBM-Neurosphären tumoriogen waren, ein Multilineage-Differenzierungspotenzial darstellten und den Genotyp des ursprünglichen Tumors bewahrten, im Gegensatz zu den 10% FBS-Kulturen, die bei niedrigen Passagen nicht tumoriogen waren und in den späten Passagen erheblich von den ursprünglichen Tumoren abwichen4.
Die Isolierung von CSC von dissoziierten GBM-Tumoren durch Zellsortierung auf der Grundlage der Expression des vermeintlichen CSC-Markers CD133 wurde ebenfalls vorgeschlagen6,7, aber weitere Arbeiten deuteten darauf hin, dass der CSC-Phänotyp nicht definitiv mit der Expression solcher Marker8-10in Verbindung gebracht wird, was die anfängliche Begeisterung für diese Strategie verringert, während neue Marker noch getestet werden10. Die bisher nicht verfügbare eines validierten Satzes von Markern, die CSC definieren, zusammen mit dem Ziel einer großflächigen Verstärkung dieser Zellen für präklinische Studien macht die Verwendung von Zellsortierung für routinemäßige CSC-angereicherte Kulturen unpraktisch. GBM-Zellen, die durch die Fähigkeit ausgewählt wurden, als Neurosphären in NMGF zu wachsen, drücken ausnahmslos neuronale Stammzellmarker aus. Wir haben beobachtet, dass Sox2 und Nestin allgegenwärtig in Neurosphärenkulturen exprimiert werden, während CD133-Protein in einer Teilmenge der GBM-Neurosphären vorhanden ist (unveröffentlichte Daten und Referenz11).
Mehrere Laboratorien verfolgen Neurosphärenkulturen aus Glioblastom-Tumoren mit dem gleichen allgemeinen Ansatz der enzymatischen Dissoziation und Kultivierung in serumfreien Medium mit Wachstumsfaktoren3,4,11-14, während andere Kollegen haben Versuche berichtet, langfristige Neurosphärenkulturen aus GBM-Proben ohne Erfolg wachsen . Die allgemeine Methode für enzymatische Dissoziation und Neurosphärenkultur von hochgradigen Gliomen, die hier vorgestellt wird, ähnelt dem, was in den obigen Veröffentlichungen beschrieben wurde. Wir haben das Protokoll auf der Grundlage unserer Erfahrungen mit der Trennung und Kultivierung von über 100 GBM-Samples optimiert. Die Effizienz der Gewinnung langfristiger Neurosphärenkulturen aus frischen GBM-Proben unter Anwendung des hier vorgestellten Protokolls beträgt über 40 %, ähnlich wie bei den wenigen Berichten, die Effizienzdaten3,15zeigen, was zur Erforschung alternativer Protokolle wie der kontinuierlichen oder zeitweise kultivierenden Zellkultivierung in serumfreiem Medium in Gegenwart von EGF und bFGF als Monolayer n. B. auf Oberflächen führt, die mit ECM-Protein16,17beschichtet sind. Neurosphärenkulturen sind immer noch der am meisten validierte und immer beliebter werdende Ansatz, um GBM-Tumoren molekulare Eigenschaften und tumorigenes Potenzialzuerhalten 3,4,11-14, daher ist unser Ansatz, Neurosphärenkulturen zuerst zu versuchen, während gleichzeitig alternative Methoden zur Kultivierung von GBM-Zellen getestet werden, die keine langfristigen selbsterneuernden Neurosphären bilden ( Abbildung1), um die Darstellung von GBM-Tumoren zu erhöhen, die in Tiermodellen verwendet werden können. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultivierung von Neurosphären aus GBMs vor. Für Zellen, die keine Neurosphären bilden, zeigen wir eine einfache Modifikation im Wachstumsmedium, als erster Versuch, tumorigene Zellen aus nichtneurosphärenden GBMs zu kultivieren, mit vielversprechenden Ergebnissen und noch immer einer umfassenden Validierung.
Die richtige enzymatische Tumorzelldissoziation ist ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Das Gewebe muss vor der Inkubation in der Zelldissoziationslösung bei 37 °C unter Rotation für mindestens 30 min gehackt werden, wenn das Gewebe mechanisch trituiert und die Verlängerung der Dissoziation überprüft werden muss. Je nach Grad des Gewebezusammenhalts kann die Inkubation um weitere 15-30 min verlängert werden, je nach Bedarf, um die Dissoziation in einzelne Zellen zu vervollständigen. Inkubation in Dissoziationslösung länger als 1 Stunde wird aufgrund der verminderten Zelllebensfähigkeit nicht empfohlen. Obwohl die optimale Menge an Startgewebe 200-500 mg beträgt, hat dieses Protokoll zu erfolgreichen Neurosphärenkulturen von nur 50 mg Tumorgewebe geführt.
Serumfreies NMGF ist ein selektives Medium, und ein Prozentsatz der neoplastischen Zellen, die den Großteil des Tumors sowie Wirtszellen umfassen, wird nicht überleben, während andere nach der Beschichtung an den mit der Gewebekultur behandelten Kolben anhaften. Es ist entscheidend, dass die Neurosphären, die sich über 1-3 Wochen bilden (Abbildungen 1B-E) auf frische Kolben übertragen werden, um sich von differenzierten Tumorzellen und Ablagerungen zu trennen.
GBM-Zellen enzymatisch dissoziiert und nie kultiviert (Schritt 1.10) können als Backup-Quelle von Zellen zur Kultur in alternativen Medien kryokonserviert werden, falls die Neurosphärenkultur versagt. Wir haben erfolgreich Neurosphärenkulturen aus solchen gefrorenen Beständen gewonnen, sowie Monolayer-Zellen, die in 2% FBS/NMGF wachsen.
Konzeptionell ist “Krebsstammzelle” eine Arbeit in Arbeit und dieses aufstrebende Feld wird von zusätzlichen Klärung profitieren, da die klinischen Implikationen erheblich sind, insbesondere bei der Erzeugung von Tumorheterogenität, Plastizität, und Resistenz gegen Therapie19,20. Die Neurosphärenkulturen sind nicht nur für die Erzeugung patientenspezifischer GBM-Tiermodelle von entscheidender Bedeutung, sondern auch für In-vitro-Studien wie die Veränderung der Zellsignalisierung und der Genexpression als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, Hypoxie und pharmakologische Wirkstoffe11,21. Wir haben uns für die Verwendung von Querschnitten von formalin fixierten und paraffinintegrierten Neurosphären entschieden, um die 3D-Architektur zu erhalten, um die Proteinexpression und posttranslationale Modifikationen durch Immunhistochemie11zu untersuchen, aufgrund der überlegenen subzellulären Lokalisation in Bezug auf die häufigere Methode der Kennzeichnung und Abbildung der gesamten Sphäre.
Es hat sich gezeigt, dass nicht alle Zellen innerhalb von Neurosphären aus adulten Säugetiergehirn abgeleitet sind Stammzellen22. In ähnlicher Weise sind die Neurosphären, die von GBM-Tumoren kultiviert werden, wahrscheinlich nicht klonal, aufgrund der Anwesenheit von differenzierteren Krebsvorläuferzellen und Selbstaggregation, bekannt, bei hohen Zelldichten auftreten23, die eine Einschränkung dieser Methode von einigen betrachtet wird. Um die Anreicherung für langfristige, sich selbst erneuernde Stammzellen zu begünstigen, im Gegensatz zu nur Vorläufern, die vorübergehend als Neurosphären wachsen können22, werden die primären Neurosphären für die sekundäre Neurosphärenbildung dissoziiert und für mindestens 10 Passagen weitergeführt, was in etwa 2 Monaten in der kontinuierlichen Kultur entspricht, was ein Hinweis auf eine in Stammzellen angereicherte Populationist 22. Unserer Erfahrung nach können GBM-Neurosphärenkulturen, die diese Marke erreichen, auf unbestimmte Zeit als Neurosphären erweitert werden. Tumor-Grade ist wichtig, da wir erfolgreiche Kulturen von GBMs und anaplastischen Astrozytomen, WHO-Grad IV bzw. III, aber nicht von niedrigeren Gliomen erhalten haben.
Die am weitesten verbreitete Methode zur Kultivierung von Glioblastomzellen, in traditionellen Wachstumsmedium mit 10% FBS ergänzt, führt zu erheblichen genomischen und phänotypischen Divergenz von den ursprünglichen Tumoren 4. Auf der anderen Seite sind Neurosphärenkulturen eine stabile und langfristige Quelle von Zellen, die Krebsstammzellphänotyp4präsentieren. Die Neurosphärenmethode ist für die Anreicherung von CSC in Langzeitkulturen für orthotopische Maus-Xenograft-Modelle immer beliebter geworden, obwohl sie nicht für alle hochwertigen Astrozytomproben erfolgreich ist, was die Hauptschwäche dieser Methode darstellt. Studien, um zu verstehen, wie molekulare Eigenschaften der elterlichen Tumoren die Bildung der Neurosphäre beeinflussen können, sind im Gange. Die Erforschung praktischer alternativer Methoden zu kulturhochwertigen Gliomen, gefolgt von einer umfassenden Validierung, wird angesichts der bedeutsamen Vorteile patientenspezifischer GBM-Modelle gewährt, während wir in eine Ära der personalisierten Medizin vordringen, die durch die Zugänglichkeit von “omics”-Informationen und eine erhöhte Anzahl potenzieller gezielter Therapien angetrieben wird.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital, finanziert.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |