פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.
Glioblastomas, הצורה הנפוצה והאגרסיבית ביותר של אסטרוציטומה, הם עקשן לטיפול, והטרוגני מולקולרית. היכולת להקים תרביות תאים המשמרות את הפרופיל הגנומי של גידולי ההורים, לשימוש במודלים ספציפיים למטופל במבחנה וב-vivo, יש פוטנציאל לחולל מהפכה בהתפתחות הפרה-קולינית של טיפולים חדשים לגלובלסטומה המותאמים למאפיינים המולקולריים של כל גידול.
החל מגידולי אסטרוציטומה טריים בדרגה גבוהה המנותקים לתאים בודדים, אנו משתמשים במדורה הנוירוספרית כשיטת העשרה לתאים המציגים פנוטיפ של תאי גזע סרטניים, כולל ביטוי של סמני תאי גזע עצביים, חידוש עצמי ארוך טווח במבחנה, והיכולת ליצור גידולים אורתוטופיים קסנוגרפט. שיטה זו הוצעה בעבר, וכעת היא נמצאת בשימוש על ידי מספר חוקרים. בהתבסס על הניסיון שלנו של ניתוק ו culturing 125 דגימות גליובלסטומה, הגענו לפרוטוקול המפורט שאנו מציגים כאן, מתאים פולחן נוירוספרה שגרתית של astrocytomas בדרגה גבוהה והתרחבות בקנה מידה גדול של תאים tumorigenic למחקרים פרה-קוליניים. אנו מדווחים על היעילות של תרבויות מוצלחות לטווח ארוך באמצעות פרוטוקול זה ומציעים חלופות סבירות עבור culturing תאי גליובלסטומה מנותקים שאינם מצליחים לגדול כמו נוירוספרות. אנו גם מתארים בפירוט פרוטוקול לשימור הארכיטקטורה הנוירוספרית בתלת-ממד לאימונוהיסטוכימיה. תרביות תאים מועשרות ב- CSCs, המסוגלות ליצור מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט המשמרים את החתימות המולקולריות וההטרוגניות של GBMs, הופכות פופולריות יותר ויותר לחקר הביולוגיה של GBMs ולעיצוב משופר של בדיקות פרה-קוליניות של טיפולים פוטנציאליים.
גליובלסטומה (GBM), אסטרוציטומה בדרגה IV של ארגון המחשב העולמי, היא הגידול העיקרי הנפוץ והאגרסיבי ביותר במוח. פנוטיפים התפתחותיים מגוונים מאומצים על ידי תאים סרטניים GBM, כולל תאים המציגים “תא גזע סרטני” (CSC) מאפיינים, כגון הביטוי של תאי גזע עצביים (NSC) סמנים, התחדשות עצמית לטווח ארוך, ואת הפוטנציאל להוליד תאים מובחנים יותר להביע סמנים אסטרוציטיים ויוצרים את החלק הארי של הגידול1-3. בעוד הבהרה עדיין נדרשת לגבי זהות מולקולרית CSC והשלכות קליניות, המוקד של העבודה הנוכחית היא על ההגדרה התפעולית של CSC: התחדשות עצמית לטווח ארוך במבחנה ואת היכולת להבדיל ולשכפל את הגידול המקורי על השתלה אורתוטופית מכרסמים immunocompromised.
תאי גליובלסטומה כבר תרבית במשך עשרות שנים במדיום מסורתי המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) וכמה מעברים גבוהים זמינים מסחרית סרום קווי תאים GBM מתורבת הם tumorigenic במכרסמים immunocompromised, אבל יש הבדל גנומי ומולקולרי ניכר מן הגידול המקורי4, הגבלת השימוש בהם כמודלים רלוונטיים קלינית. לאחרונה, תאים עם פנוטיפ גזע / אב מגיב EGF ו bFGF זוהו GBMs2. לאחר מכן, דגימות גידול GBM מנותקות היו מתורבתות במדיום ללא סרום3, נוסחה במקור לבחירה והרחבת תאי גזע עצביים ממוחו של היונק הבוגר5. תנאי תרבות אלה לעכב את הצמיחה של רוב אוכלוסיות תאים סרטניים nonneoplastic ויותר מובחנים, תוך העדפת הצמיחה של תאי גזע ואביזרים כמו ספרואידים רב תאיים צפים, או נוירוספרות3, מחקה את ההתנהגות של תאי גזע עצביים יונקים בוגרים5. השוואה מקיפה זה לצד זה של תאי GBM ראשוניים בתרבית בינונית נוירוספרית בתוספת גורמי גדילה (NMGF) או במדיום הצמיחה המסורתי בתוספת 10% FBS, גילה כי neurospheres GBM היו tumorigenic, הציג פוטנציאל בידול רב לשוני, ושימר את הגנוטיפ של הגידול המקורי, בניגוד 10% תרבויות FBS אשר לא היו tumorigenic במעברים נמוכים במידה ניכרת סטה מן הגידולים המקוריים במעברים מאוחרים4.
בידוד של CSC מגידולים GBM מנותקים על ידי מיון תאים בהתבסס על הביטוי של סמן CSC putative CD133 הוצע גם 6,7, אבל עבודה נוספת הצביעה עלכךפנוטיפ CSC אינו קשור באופן סופי עם הביטוי של סמנים כאלה8-10, הפחתת ההתלהבות הראשונית עבור אסטרטגיה זו, ואילו סמנים חדשים עדיין נבדקים10. חוסר הזמינות עד כה של קבוצה מאומתת של סמנים המגדירים CSC, יחד עם המטרה של הגברה בקנה מידה גדול של תאים אלה למחקרים פרה-קוליניים, הופך את השימוש במיון תאים לבלתי מעשי עבור תרבויות שגרתיות המועשרות ב- CSC. תאי GBM שנבחרו על ידי היכולת לגדול כנוירוספרות ב- NMGF מבטאים תמיד סמני תאי גזע עצביים. ראינו כי Sox2 ו nestin באים לידי ביטוי בכל מקום בתרבויות נוירוספרה, בעוד חלבון CD133 קיים בקבוצת משנה של נוירוספרות GBM (נתונים שלא פורסמו התייחסות11).
מספר מעבדות רודפות אחר תרבויות נוירוספריות מגידולי גליובלסטומה באמצעות אותה גישה כללית של דיסוציאציה אנזימטית ופולחן במדיום ללא סרום בתוספת גורמיגדילה 3,4,11-14, בעוד עמיתים אחרים דיווחו על ניסיונות לגדל תרבויות נוירוספריות לטווח ארוך מדגימות GBM ללא הצלחה . השיטה הכללית לדיסוציאציה אנזימטית ותרבות נוירוספרית של גליומות בדרגה גבוהה המוצגות כאן דומה למה שתואר בפרסומים לעיל. אופטימיזציה של הפרוטוקול מבוסס על הניסיון שלנו של ניתוק ו culturing מעל 100 GBM דגימות. היעילות של קבלתתרבויותנוירוספריות לטווח ארוך מדגימות GBM טריות החלת הפרוטוקול המוצג כאן הוא מעל 40%, בדומה לדיווחים המעטים המראים נתוני יעילות 3,15, המוביל לחקירה של פרוטוקולים חלופיים כגון תאים culturing ללא הרף או לסירוגין במדיום ללא סרום בנוכחות EGF ו bFGF כמו monolayers על משטחים מצופים חלבון ECM16,17. תרבויות נוירוספרה הם עדיין הגישה המאומתת והפופולרית יותרויותרכדי לשמר גידולים GBM מאפיינים מולקולריים ופוטנציאל tumorigenic 3,4,11-14, ולכן הגישה שלנו היא לנסות תרבויות נוירוספרות הראשון, תוך בדיקה זמנית של שיטות חלופיות ליצירת תאי GBM שאינם מצליחים ליצור נוירוספרות מתחדשות-עצמית לטווח ארוך ( איור 1 ), כדי להגדיל את הייצוג של גידולים GBM שניתן להשתמש בהם במודלים של בעליחיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לתיכנות נוירוספרות מ- GBMs. עבור תאים שאינם מצליחים ליצור נוירוספרות, אנו מראים שינוי פשוט במדיום הצמיחה, כניסיון הראשון לתרבות תאים tumorigenic מן nonneurosphere להרכיב GBMs, עם תוצאות מבטיחות ועדיין עובר אימות נרחב.
דיסוציאציה נכונה של תאי גידול אנזימטיים היא צעד קריטי בפרוטוקול זה. הרקמה חייבת להיות טחון הרבה לפני הדגירה בתמיסת דיסוציאציה של התא ב 37 מעלות צלזיוס תחת סיבוב, במשך מינימום של 30 דקות, כאשר הרקמה חייבת להיות משולש מכנית ואת הארכת הדיסוציאציה מאומתת. בהתאם למידת לכידות הרקמה, ניתן להאריך את הדגירה למשך 15-30 דקות נוספות, לפי הצורך כדי להשלים את הניתוק לתאים בודדים. דגירה בתמיסת דיסוציאציה במשך יותר משעה אינה מומלצת עקב ירידה בכדאיות התא. למרות הכמות האופטימלית של רקמה התחלתית היא 200-500 מ”ג, פרוטוקול זה הוביל תרבויות נוירוספרה מוצלחת מ קטן כמו 50 מ”ג של רקמת הגידול.
NMGF ללא סרום הוא מדיום סלקטיבי, ואחוז מהתאים הניאופלסטיים המרכיבים את עיקר הגידול, כמו גם תאים מארחים, לא ישרדו, בעוד שאחרים יתחברו לתרבות הרקמות שטופלה בבקבוקון לאחר הציפוי. זה קריטי כי נוירוספרות שייווצרו מעל 1-3 שבועות (איורים 1B-E) מועברים בקבוקונים טריים, להיפרד תאים סרטניים מובחנים ופסולת.
תאי GBM מנותקים אנזימטית ולעולם לא מתורבתים (שלב 1.10) יכולים להיות קריאופושמור כמקור גיבוי של תאים לתרבות במדיה אלטרנטיבית, במקרה שהתרבות הנוירוספרית נכשלת. השגנו בהצלחה תרבויות נוירוספריות ממלאי קפוא כזה, כמו גם תאים חד שכבתיים הגדלים ב-2% FBS/NMGF.
מבחינה מושגית, “תא גזע סרטני” הוא עבודה בתהליך ותחום מתפתח זה ייהנה מהבהרה נוספת, שכן ההשלכות הקליניות הן משמעותיות, במיוחד בדור של הטרוגניות הגידול, פלסטיות, והתנגדות לטיפול1 9,20. בנוסף להיותו חיוני ליצירת מודלים מסוימים של בעלי חיים GBM המטופל, תרבויות נוירוספרה הם גם בעלי ערך עבור מחקרים במבחנה כגון שינוי איתות התא ביטוי גנים בתגובה גורמי גדילה, היפוקסיה, וסוכניםתרופתיים 11,21. בחרנו להשתמש בחתכים של נוירוספרות משובצות פורמלין ופרפין, שמירה על ארכיטקטורת תלת-ממד, ללמוד ביטוי חלבון ושינויים פוסט-תרגומיים על ידי אימונוהיסטוכימיה11, בשל לוקליזציה תת-תאית מעולה ביחס לשיטה הנפוצה יותר של תיוג והדמיה של הספירה כולה.
הוכח כי לא כל התאים בתוך נוירוספרות נגזר המוח יונקים בוגרים הם תאי גזע22. באופן דומה, נוירוספרות מתורבת גידולים GBM סביר להניח לא שיבוט, בשל נוכחותם של תאים אבות סרטניים מובחנים יותר וצבירה עצמית, ידוע להתרחש בצפיפות תאים גבוהה23, אשר נחשב מגבלה של שיטה זו על ידי כמה. כדי להעדיף העשרה לתאי גזע מתחדשים לטווח ארוך, בניגוד רק אבות אשר יכול לגדול באופן חולף כמו נוירוספרות22, נוירוספרות העיקרי מנותקים להיווצרות נוירוספרה משנית, ומעבר נוסף עבור מינימום של 10 קטעים, שווה בערך 2 חודשים בתרבות רציפה, המהווה אינדיקציה של אוכלוסייה מועשרת בתאי גזע22. מניסיוננו, תרבויות נוירוספריות GBM המשיגות את הסימן הזה יכולות להמשיך להתרחב כמו נוירוספרות ללא הגבלת זמן. כיתה הגידול חשוב, שכן השגנו תרבויות מוצלחות מ GBMs ו astrocytomas אנאפלסטי, WHO כיתה IV ו- III, בהתאמה, אבל לא מ gliomas כיתה נמוכה יותר.
השיטה הנפוצה ביותר של culturing תאים גליובלסטומה, במדיום הצמיחה המסורתי בתוספת 10% FBS, מוביל הבדל גנומי ופנוטיפי ניכר מן הגידולים המקוריים 4. מצד שני, תרבויות נוירוספריות הן מקור יציב וארוך טווח של תאים המציגים פנוטיפ תא גזע סרטני4. השיטה neurosphere הפך פופולרי יותר ויותר עבור העשרה של CSC בתרבויות לטווח ארוך עבור מודלים קסנוגרפט עכבר אורתוטופי, למרות שלא היה מוצלח עבור כל דגימות אסטרוציטומה בדרגה גבוהה, המייצג את החולשה העיקרית של שיטה זו. מחקרים כדי להבין כיצד מאפיינים מולקולריים של גידולים הוריים יכולים להשפיע על היווצרות נוירוספרה נמצאים בעיצומה. חקירה של שיטות חלופיות מעשיות לתרבות gliomas כיתה גבוהה, ואחריו אימות נרחב מוענקים, בהתחשב ביתרונות חשובים של בעל מודלים GBM ספציפי החולה, כפי שאנו מתקדמים לעידן של רפואה מותאמת אישית, מונע על ידי הנגישות של מידע “omics” ומספר גדל של טיפולים ממוקדים פוטנציאליים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי המרכז לגידול במוח הרמלין, בית החולים הנרי פורד.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |