Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.
Glioblastomen, de meest voorkomende en agressieve vorm van astrocytoom, zijn vuurvast voor therapie en moleculair heterogeen. Het vermogen om celculturen op te zetten die het genomische profiel van de oudertumoren behouden, voor gebruik in patiëntspecifieke in vitro en in vivo modellen, heeft het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de preklinische ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor glioblastoom die zijn afgestemd op de moleculaire kenmerken van elke tumor.
Beginnend met verse hoogwaardige astrocytoomtumoren gedissocieerd in enkele cellen, gebruiken we de neurosfeertest als een verrijkingsmethode voor cellen die kankerstamcelfenotype presenteren, inclusief expressie van neurale stamcelmarkers, langdurige zelfvernieuwing in vitroen het vermogen om orthotopische xenografttumoren te vormen. Deze methode is eerder voorgesteld en wordt nu door verschillende onderzoekers gebruikt. Op basis van onze ervaring met het scheiden en cultiveren van 125 glioblastoommonsters, kwamen we tot het gedetailleerde protocol dat we hier presenteren, geschikt voor routinematige neurosfeerculering van hoogwaardige astrocytomen en grootschalige uitbreiding van tumorigenic cellen voor preklinische studies. We rapporteren over de efficiëntie van succesvolle langetermijnculturen met behulp van dit protocol en stellen betaalbare alternatieven voor het kweken van gedissocieerde glioblastoomcellen voor die niet groeien als neurosferen. We beschrijven ook in detail een protocol voor het behoud van de neurosferen 3D-architectuur voor immunohistochie. Celculturen verrijkt met CCC’s, die orthotopische xenograftmodellen kunnen genereren die de moleculaire handtekeningen en heterogeniteit van GBM’s behouden, worden steeds populairder voor de studie van de biologie van GBM’s en voor het verbeterde ontwerp van preklinische tests van potentiële therapieën.
Glioblastoom (GBM), een WHO graad IV astrocytoom, is de meest voorkomende en agressieve primaire hersentumor. Diverse ontwikkelingsfenotypes worden overgenomen door GBM-tumorcellen, waaronder cellen die kenmerken van “kankerstamcel” (CSC) vertonen, zoals de expressie van neurale stamcelmarkers (NSC), langdurige zelfvernieuwing en het potentieel om meer gedifferentieerde cellen te creëren die astrocytische markers uitdrukken en het grootste deel van de tumorvormen 1-3. Hoewel er nog steeds verduidelijking nodig is met betrekking tot de moleculaire identiteit van CSC en klinische implicaties, ligt de focus van dit werk op de operationele definitie van CSC: langdurige zelfvernieuwing in vitro en het vermogen om de oorspronkelijke tumor te differentiëren en te reproduceren bij orthotopische implantatie bij immuungecompromitteerde knaagdieren.
Glioblastoomcellen worden al tientallen jaren gekweekt in traditioneel medium met 10% foetale runderserum (FBS) en verschillende in de handel verkrijgbaar serum gekweekte GBM-cellijnen zijn tumorigeen bij immuungecompromitteerde knaagdieren, maar er is aanzienlijke genomische en moleculaire divergentie van de oorspronkelijke tumor4, waardoor het gebruik ervan als klinisch relevante modellen wordt beperkt. Meer recent werden cellen met stam/voorloperfenotype dat reageert op EFG en bFGF geïdentificeerd in GBM’s2. Vervolgens werden gedissocieerde GBM-tumormonsters gekweekt in een serumvrij medium3, oorspronkelijk geformuleerd voor de selectie en uitbreiding van neurale stamcellen uit de volwassen zoogdierhersenen5. Deze kweekomstandigheden belemmeren de groei van de meeste niet-neuroplastische en meer gedifferentieerde tumorcelpopulaties, terwijl ze de groei van stam- en voorlopercellen als zwevende meercellige sferoïden of neurosferen3bevorderen, waarbij het gedrag van volwassen neurale stamcellen van zoogdieren wordt nagebootst5. Uitgebreide vergelijking van primaire GBM-cellen gekweekt in neurosfeermedium aangevuld met groeifactoren (NMGF) of in het traditionele groeimedium aangevuld met 10% FBS, onthulde dat de GBM-neurosferen tumorigeen waren, multilineage differentiatiepotentieel presenteerden en het genotype van de oorspronkelijke tumor behielden, in tegenstelling tot de 10% FBS-culturen die niet tumorigeen waren bij lage passages en aanzienlijk verschilden van de oorspronkelijke tumoren bij latepassages.
Isolatie van CSC van gedissocieerde GBM-tumoren door celsortering op basis van de expressie van putatieve CSC-marker CD133 is ook voorgesteld6,7, maar verder onderzoek wees uit dat het CSC-fenotype niet definitief geassocieerd is met de expressie van dergelijke markers8-10, waardoor het aanvankelijke enthousiasme voor deze strategie afneemt , terwijl nieuwe markers nog steeds worden getest10. De onbeschikbaarheid tot nu toe van een gevalideerde set markers die CSC definiëren, samen met het doel van grootschalige versterking van deze cellen voor preklinische studies, maakt het gebruik van celsortering onpraktisch voor routinematige CSC-verrijkte culturen. GBM-cellen geselecteerd door het vermogen om te groeien als neurosferen in NMGF drukken steevast neurale stamcelmarkers uit. We hebben waargenomen dat Sox2 en nestine alomtegenwoordig worden uitgedrukt in neurosfeerculturen, terwijl CD133-eiwit aanwezig is in een subset van de GBM-neurosferen (ongepubliceerde gegevens en referentie11).
Verschillende laboratoria streven neurosfeerculturen na van glioblastoomtumoren met dezelfde algemene benadering van enzymatische dissociatie en cultivering in serumvrij medium aangevuld met groeifactoren3,4,11-14, terwijl andere collega’s pogingen hebben gemeld om neurosfeerculturen op lange termijn zonder succes uit GBM-monsters te laten groeien . De hier gepresenteerde algemene methode voor enzymatische dissociatie en neurosfeercultuur van hoogwaardige gliomen is vergelijkbaar met wat in de bovenstaande publicaties is beschreven. We hebben het protocol geoptimaliseerd op basis van onze ervaring met het dissocieren en cultiveren van meer dan 100 GBM-monsters. De efficiëntie van het verkrijgen van neurosfeerculturen op lange termijn uit verse GBM-monsters die het hier gepresenteerde protocol toepassen, is meer dan 40%, vergelijkbaar met de weinige rapporten die efficiëntiegegevens3,15tonen , wat leidt tot de exploratie van alternatieve protocollen zoals het voortdurend of met tussenpozen cultiveren van cellen in serumvrij medium in aanwezigheid van EFG en bFGF als monolagen op oppervlakken bedekt met ECM-eiwit16,17. Neurosfeerculturen zijn nog steeds de meest gevalideerde en steeds populairdere benadering om GBM-tumoren moleculaire kenmerken en tumorigeen potentieel3,4,11-14te behouden , dus onze aanpak is om eerst neurosfeerculturen te proberen, terwijl we tegelijkertijd alternatieve methoden testen voor het cultiveren van GBM-cellen die geen langdurige zelfvernieuwende neurosferen vormen ( figuur1), om de representatie van GBM-tumoren die in diermodellen kunnen worden gebruikt, te vergroten. Hier presenteren we een protocol voor het cultiveren van neurosferen van GBM’s. Voor cellen die geen neurosferen vormen, laten we een eenvoudige wijziging in het groeimedium zien, als de eerste poging om tumorogene cellen uit niet-neurosfeervormende GBM’s te cultaculeren, met veelbelovende resultaten en nog steeds uitgebreide validatie ondergaan.
Een goede enzymatische tumorceldissociatie is een cruciale stap in dit protocol. Het weefsel moet ruim vóór incubatie in celdissociatieoplossing bij 37 °C bij rotatie worden gehakt, gedurende ten minste 30 minuten, wanneer het weefsel mechanisch moet worden getand en de verlenging van de dissociatie moet worden geverifieerd. Afhankelijk van de mate van weefselcohesie kan de incubatie met extra 15-30 minuten worden verlengd, indien nodig om dissociatie in enkele cellen te voltooien. Incubatie in dissociatieoplossing langer dan 1 uur wordt niet aanbevolen vanwege verminderde levensvatbaarheid van de cel. Hoewel de optimale hoeveelheid startweefsel 200-500 mg is, heeft dit protocol geleid tot succesvolle neurosfeerculturen vanaf slechts 50 mg tumorweefsel.
Serumvrije NMGF is een selectief medium en een percentage neoplastische cellen dat het grootste deel van de tumor en gastheercellen omvat, zal het niet overleven, terwijl anderen zich na het plateren aan de met weefselkweek behandelde kolf hechten. Het is van cruciaal belang dat de neurosferen die zich gedurende 1-3 weken zullen vormen (figuren 1B-E) worden overgebracht naar verse kolven, om zich te scheiden van gedifferentieerde tumorcellen en puin.
GBM-cellen die enzymatisch worden gedissocieerd en nooit gekweekt (stap 1.10) kunnen worden gebruikt als een back-upbron van cellen naar cultuur in alternatieve media, voor het geval de neurosfeercultuur faalt. We hebben met succes neurosfeerculturen verkregen uit dergelijke bevroren voorraden, evenals monolaagcellen die groeien in 2% FBS / NMGF.
Conceptueel gezien is “kankerstamcel” een werk in uitvoering en dit opkomende veld zal baat hebben bij aanvullende verduidelijking, aangezien de klinische implicaties aanzienlijk zijn, met name bij de generatie van tumor heterogeniteit, plasticiteit en resistentie tegen therapie19,20. De neurosfeerculturen zijn niet alleen van vitaal belang voor het genereren van patiëntspecifieke GBM-diermodellen, maar zijn ook waardevol voor in vitro studies zoals verandering in celsignalering en genexpressie als reactie op groeifactoren, hypoxie en farmacologischemiddelen 11,21. We hebben gekozen voor het gebruik van doorsneden van formaline vaste en paraffine ingebedde neurosferen, het behoud van de 3D-architectuur, om eiwitexpressie en post-translationele modificaties door immunohistochie11te bestuderen, vanwege de superieure subcellulaire lokalisatie met betrekking tot de meer gebruikelijke methode om de hele bol te labelen en in beeld te brengen.
Het is aangetoond dat niet alle cellen in neurosferen afgeleid van volwassen zoogdierhersenen stamcellen zijn22. Evenzo zijn de neurosferen gekweekt uit GBM-tumoren waarschijnlijk niet clonal, vanwege de aanwezigheid van meer gedifferentieerde kankervoorlopercellen en zelfaggregatie, waarvan bekend is dat ze optreden bij hoge celdichtheden23, wat door sommigen als een beperking van deze methode wordt beschouwd. Om verrijking voor zelfvernieuwende stamcellen op lange termijn te bevorderen, in tegenstelling tot alleen voorlopers die tijdelijk kunnen groeien als neurosferen22, worden de primaire neurosferen gedissocieerd voor secundaire neurosfeervorming en verder gepasseerd gedurende minimaal 10 passages, ongeveer gelijk aan 2 maanden in continue cultuur, wat een indicatie is van een populatie verrijkt met stamcellen22. Onze ervaring is dat GBM-neurosfeerculturen die dat doel bereiken, voor onbepaalde tijd als neurosferen kunnen worden uitgebreid. Tumorkwaliteit is belangrijk, omdat we succesvolle culturen hebben verkregen van GBM’s en anaplastische astrocytomen, respectievelijk WHO-graad IV en III, maar niet van gliomen van lagere kwaliteit.
De meest voorkomende methode voor het cultiveren van glioblastoomcellen, in traditioneel groeimedium aangevuld met 10% FBS, leidt tot aanzienlijke genomische en fenotypische divergentie van de oorspronkelijke tumoren 4. Aan de andere kant zijn neurosfeerculturen een stabiele en langdurige bron van cellen die kankerstamcelfenotype4presenteren. De neurosfeermethode is steeds populairder geworden voor de verrijking van CSC in langetermijnculturen voor orthotopische muis xenograftmodellen, ondanks het feit dat het niet succesvol is voor alle hoogwaardige astrocytoommonsters, wat de belangrijkste zwakte van deze methode vertegenwoordigt. Studies om te begrijpen hoe moleculaire kenmerken van de ouderlijke tumoren de neurosfeervorming kunnen beïnvloeden, zijn aan de gang. Verkenning van praktische alternatieve methoden voor cultuur hoogwaardige gliomen, gevolgd door uitgebreide validatie, wordt verleend, gezien de belangrijke voordelen van het hebben van patiëntspecifieke GBM-modellen, naarmate we verder gaan in een tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde, gevoed door de toegankelijkheid van “omics” -informatie en een toenemend aantal potentiële gerichte therapieën.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk is gefinancierd door het Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |