Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.
Los glioblastomas, la forma más común y agresiva de astrocitoma, son refractarios a la terapia y molecularmente heterogéneos. La capacidad de establecer cultivos celulares que preserven el perfil genómico de los tumores parentales, para su uso en modelos in vitro e in vivo específicos para pacientes, tiene el potencial de revolucionar el desarrollo preclínico de nuevos tratamientos para el glioblastoma adaptados a las características moleculares de cada tumor.
Comenzando con los tumores frescos del astrocytoma de alto grado disociados en solas células, utilizamos el análisis de la neurosfera como método del enriquecimiento para las células que presentan fenotipo de la célula madre del cáncer, incluyendo la expresión de los marcadores de los nervios de la célula madre, la uno mismo-renovación a largo plazo in vitro,y la capacidad de formar tumores orthotopic del xenograft. Este método ha sido propuesto previamente, y ahora está en uso por varios investigadores. De acuerdo con nuestra experiencia de disociar y de cultivar 125 especímenes del glioblastoma, llegamos al protocolo detallado que presentamos aquí, conveniente para el cultivo rutinario de la neurosfera de astrocytomas de alto grado y la extensión en grande de células tumorigenic para los estudios preclínicos. Divulgamos sobre la eficacia de culturas a largo plazo acertadas usando este protocolo y sugerimos alternativas asequibles para cultivar las células disociadas del glioblastoma que no pueden crecer como neuroesferas. También describimos en detalle un protocolo para preservar la arquitectura 3D de las neuroesferas para la inmunohistoquímica. Los cultivos celulares enriquecidos en CSCs, capaces de generar modelos de xenoinjerto ortotópicos que preservan las firmas moleculares y la heterogeneidad de los GBMs, son cada vez más populares para el estudio de la biología de los GBMs y para el diseño mejorado de las pruebas preclínicas de terapias potenciales.
El glioblastoma (GBM), un astrocitoma de grado IV de la OMS, es el tumor cerebral primario más prevalente y agresivo. Diversos fenotipos de desarrollo son adoptados por las células tumorales GBM, incluyendo células que exhiben características de “células madre cancerosas” (CSC), como la expresión de marcadores de células madre neurales (NSC), auto-renovación a largo plazo, y el potencial de dar lugar a células más diferenciadas que expresan marcadores astrocíticos y forman la mayor parte del tumor1-3. Mientras que la clarificación todavía es necesaria con respecto a identidad molecular de CSC e implicaciones clínicas, el foco del actual trabajo está en la definición operacional de CSC: la uno mismo-renovación de largo plazo in vitro y la capacidad de distinguir y de reproducir el tumor original sobre la implantación orthotopic en roedores immunocompromised.
Las células del glioblastoma se han cultivado durante décadas en el medio tradicional que contiene el suero bovino fetal del 10% (FBS) y varias variedades de células del GBM cultivadas suero del suero del alto paso comercial son tumorigenic en roedores immunocompromised, pero hay considerable divergencia genomic y molecular del tumor original4,limitando su uso como modelos clínico relevantes. Más recientemente, se identificaron células con fenotipo madre/progenitor sensible al EGF y al bFGF en los GBMs2. Posteriormente, se cultivaron muestras de tumores gbm disociados en un medio libre de suero3,originalmente formulado para la selección y expansión de células madre neurales del cerebro de mamífero adulto5. Estas condiciones de cultivo dificultan el crecimiento de la mayoría de las poblaciones de células tumorales no neoplásicas y más diferenciadas, a la vez que favorecen el crecimiento de células madre y progenitoras como esferoides multicelulares flotantes, o neuroesferas3,imitando el comportamiento de las células madre neurales de mamíferos adultos5. La comparación completa lado a lado de las células primarias de GBM cultivadas en cualquier medio de la neuroesfera complementado con factores de crecimiento (NMGF) o en el medio de crecimiento tradicional complementado con FBS del 10%, reveló que las neuroesferas de GBM eran tumorigenic, presentaron potencial de la diferenciación del multilineage, y preservaron el genotipo del tumor original, en contraste con las culturas del 10% FBS que no eran tumorigenic en los pasos bajos y divergieron considerablemente de los tumores originales en los últimos pasajes4.
También se ha propuesto el aislamiento de CSC de tumores de GBM disociados por clasificación celular basada en la expresión del supuesto marcador CSC CD1336,7,pero trabajos posteriores indicaron que el fenotipo CSC no está definitivamente asociado a la expresión de talesmarcadores 8-10,disminuyendo el entusiasmo inicial por esta estrategia, mientras que nuevos marcadores aún están siendoprobados 10. La indisponibilidad hasta la fecha de un conjunto validado de marcadores que definen CSC, junto con el objetivo de la amplificación a gran escala de estas células para estudios preclínicos, hace que el uso de la clasificación celular sea poco práctico para los cultivos rutinarios enriquecidos con CSC. Las células GBM seleccionadas por la capacidad de crecer como neuroesferas en NMGF invariablemente expresan marcadores de células madre neurales. Hemos observado que Sox2 y nestin se expresan ubicuamente en cultivos de neuroesfera, mientras que la proteína CD133 está presente en un subconjunto de las neuroesferas GBM (datos inéditos y referencia11).
Varios laboratorios están persiguiendo cultivos de neuroesfera de tumores de glioblastoma utilizando el mismo enfoque general de disociación enzimática y cultivo en medio libre de suero complementado con factores de crecimiento3,4,11-14,mientras que otros colegas han reportado intentos de cultivar cultivos de neurosfera a largo plazo a partir de muestras de GBM sin éxito. El método general para la disociación enzimática y la cultura de la neuroesfera de los gliomas de alto grado presentados aquí es similar a qué se ha delineado en las publicaciones antedichos. Hemos optimizado el protocolo basado en nuestra experiencia de disociación y cultivo de más de 100 muestras GBM. La eficiencia de la obtención de cultivos de neuroesfera a largo plazo a partir de muestras frescas de GBM aplicando el protocolo aquí presentado es superior al 40%, similar a los pocos informes que muestran datos de eficiencia3,15,lo que lleva a la exploración de protocolos alternativos como el cultivo de células de forma continua o intermitente en medio sérico en presencia de EGF y bFGF como monocapas en superficies recubiertas con proteína ECM16,17. Los cultivos de neuroesfera siguen siendo el enfoque más validado y cada vez más popular para preservar las características moleculares de los tumores GBM y el potencial tumorigenic3,4,11-14,por lo tanto, nuestro enfoque es intentar los cultivos de neuroesferas primero, mientras que concomitantemente probamos métodos alternativos para cultivar células GBM que no pueden formar neuroesferas autorrenuentes a largo plazo(Figura 1),para aumentar la representación de los tumores GBM que se pueden utilizar en modelos animales. Aquí presentamos un protocolo para el cultivo de neuroesferas a partir de GBMs. Para las células que no logran formar neuroesferas, mostramos una modificación simple en el medio de crecimiento, como el primer intento de cultivar células tumorígenas de la no neuroesfera formando GBMs, con resultados prometedores y aún en proceso de validación extensa.
La disociación enzimática apropiada de la célula del tumor es un paso crítico en este protocolo. El tejido deberá ser picado bien antes de la incubación en solución de disociación celular a 37 °C bajo rotación, durante un mínimo de 30 min, cuando el tejido deba ser triturado mecánicamente y verificada la extensión de la disociación. Dependiendo del grado de cohesión del tejido, la incubación se puede extender durante 15-30 minutos adicionales, según sea necesario para completar la disociación en células individuales. No se recomienda la incubación en solución de disociación durante más de 1 hora debido a la disminución de la viabilidad celular. Aunque la cantidad óptima de tejido que comienza sea magnesio 200-500, este protocolo ha llevado a las culturas acertadas de la neuroesfera de tan poco como el magnesio 50 del tejido del tumor.
El NMGF sin suero es un medio selectivo, y un porcentaje de células neoplásicas que comprenden la mayor parte del tumor, así como las células huésped, no sobrevivirá, mientras que otras se unirán al matraz tratado cultivo de tejidos después del revestimiento. Es fundamental que las neuroesferas que se formarán durante 1-3 semanas(Figuras 1B-E)se transfieran a matraces frescos, para separar de las células tumorales diferenciadas y los restos.
Las células GBM disociadas enzimáticamente y nunca cultivadas (paso 1.10) pueden ser criopreservadas como fuente de respaldo de células para cultivar en medios alternativos, en caso de que el cultivo de la neuroesfera falle. Hemos obtenido con éxito cultivos de neuroesfera de tales poblaciones congeladas, así como células monocapa que crecen en 2% FBS / NMGF.
Conceptualmente, la “célula madre cancerosa” es un trabajo en progreso y este campo emergente se beneficiará de una clarificación adicional, ya que las implicaciones clínicas son considerables, particularmente en la generación de heterogeneidad tumoral, plasticidad y resistencia a la terapia19,20. Además de ser vitales para generar modelos animales de GBM específicos para cada paciente, los cultivos de neuroesfera también son valiosos para estudios in vitro como la alteración en la señalización celular y la expresión génica en respuesta a factores de crecimiento, hipoxia y agentes farmacológicos11,21. Hemos optado por utilizar secciones transversales de neuroesferas fijas de formol y parafina incrustadas, preservando la arquitectura 3D, para estudiar la expresión de proteínas y las modificaciones postraduccionales por inmunohistoquímica11,debido a la localización subcelular superior en relación con el método más común de etiquetado e imagen de toda la esfera.
Se ha demostrado que no todas las células dentro de las neuroesferas derivadas del cerebro de mamíferos adultos son células madre22. Del mismo modo, las neuroesferas cultivadas a partir de tumores GBM probablemente no son clonales, debido a la presencia de células progenitoras cancerosas más diferenciadas y la autoa agregación, que se sabe que ocurren a altas densidades celulares23,lo que es considerado una limitación de este método por algunos. Para favorecer el enriquecimiento de las células madre autorrenovadoras a largo plazo, a diferencia de los progenitores que pueden crecer transitoriamente como neuroesferas22,las neuroesferas primarias se disocian para la formación de la neurosfera secundaria, y se pasan por un mínimo de 10 pasajes, aproximadamente equivalentes a 2 meses en cultivo continuo, lo que es una indicación de una población enriquecida en células madre22. En nuestra experiencia, las culturas de la neurosfera de GBM que alcanzan esa marca pueden continuar siendo ampliadas como neuroesferas indefinidamente. El grado tumoral importa, ya que hemos obtenido cultivos exitosos de GBMs y astrocitomas anaplásicos, grado IV y III de la OMS, respectivamente, pero no de gliomas de grado inferior.
El método más prevalente de cultivo de células de glioblastoma, en el medio de crecimiento tradicional complementado con FBS al 10%, conduce a una considerable divergencia genómica y fenotípica de los tumores originales 4. Por otro lado, los cultivos de neuroesfera son una fuente estable y a largo plazo de células que presentan el fenotipo4de células madre cancerosas. El método de la neuroesfera se ha vuelto cada vez más popular para el enriquecimiento de CSC en cultivos a largo plazo para modelos de xenoinjerto de ratón ortotópico, a pesar de no tener éxito para todas las muestras de astrocitomas de alto grado, lo que representa la principal debilidad de este método. Los estudios para entender cómo las características moleculares de los tumores parentales pueden afectar a la formación de la neurosfera están en curso. Se concede la exploración de métodos alternativos prácticos para cultivar gliomas de alto grado, seguida de una validación exhaustiva, dadas las ventajas trascendentales de tener modelos de GBM específicos para el paciente, a medida que avanzamos hacia una era de medicina personalizada, alimentada por la accesibilidad de la información “ómica” y el aumento del número de terapias dirigidas potenciales.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo ha sido financiado por el Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |