Protokoll för förökning av dissocierade höggradiga gliom kirurgiska exemplar i serum-fria neurosfär medium att välja för celler med cancer stamcell fenotyp. För exemplar som inte växer som neurosfärer föreslås ett alternativt protokoll. En paraffin inbäddning teknik för att upprätthålla 3D neurosfär arkitektur för immunocytokemi beskrivs.
Glioblastomas, den vanligaste och aggressiva formen av astrocytoma, är eldfasta till terapi och molekylärt heterogena. Förmågan att etablera cellkulturer som bevarar den genomiska profilen hos föräldratumörerna, för användning i patientspecifika in vitro- och in vivo-modeller, har potential att revolutionera den prekliniska utvecklingen av nya behandlingar för glioblastom som är skräddarsydda för varje tumörs molekylära egenskaper.
Från och med färska högkvalitativa astrocytoma tumörer dissociated i enstaka celler, använder vi neurosfären analys som en berikning metod för celler presenterar cancer stamcell fenotyp, inklusive uttryck av neurala stamcell markörer, långsiktiga självförnyelse in vitro, och förmågan att bilda ortopisk xenograft tumörer. Denna metod har tidigare föreslagits och används nu av flera utredare. Baserat på vår erfarenhet av att skilja och odla 125 glioblastomprover, kom vi fram till det detaljerade protokollet vi presenterar här, lämpligt för rutinmässig neurosfärodling av högkvalitativa astrocytomer och storskalig expansion av tumörogena celler för prekliniska studier. Vi rapporterar om effektiviteten av framgångsrika långsiktiga kulturer med hjälp av detta protokoll och föreslår prisvärda alternativ för odling dissociated glioblastom celler som misslyckas med att växa som neurosfärer. Vi beskriver också i detalj ett protokoll för att bevara neurosfärerna 3D arkitektur för immunohistokemi. Cellkulturer berikade i CSCs, som kan generera ortopiska xenograftmodeller som bevarar gbms molekylära signaturer och heterogenitet, blir alltmer populära för studier av GBMs biologi och för förbättrad design av preklinisk testning av potentiella terapier.
Glioblastoma (GBM), en WHO grad IV astrocytoma, är den vanligaste och aggressiva primära hjärntumören. Olika utvecklingsmässiga fenotyper antas av GBM tumörceller, inklusive celler som uppvisar “cancer stamcell” (CSC) egenskaper, såsom uttryck för neurala stamcellsmarkörer (NSC), långsiktig självförnyelse, och potentialen att ge upphov till mer differentierade celler som uttrycker astrocytiska markörer och bildar huvuddelen av tumör1-3. Även om klargörande fortfarande behövs när det gäller CSC molekylär identitet och kliniska konsekvenser, fokus för det nuvarande arbetet ligger på den operativa definitionen av CSC: långsiktiga självförnyelse in vitro och förmågan att differentiera och reproducera den ursprungliga tumör på ortopic implantation i immunkomprometterade gnagare.
Glioblastoma celler har odlats i årtionden i traditionella medium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och flera hög passage kommersiellt tillgängliga serum odlade GBM cellinjer är tumorigenic i immunkomprometterade gnagare, men det finns betydande genomisk och molekylär divergens från den ursprungliga tumör4, begränsa deras användning som kliniskt relevanta modeller. Mer nyligen identifierades celler med stam/stamfogen fenotyp lyhörda för EGF och bFGF i GBMs2. Därefter odlades dissocierade GBM tumör prover i ett serum-fritt medium3, ursprungligen formuleras för urval och expansion av neurala stamceller från den vuxna däggdjur hjärnan5. Dessa odlingsförhållanden hindrar tillväxten av de flesta nonneoplastiska och mer differentierade tumörcellspopulationer, samtidigt som de gynnar tillväxten av stam- och stamceller som flytande multicellulära sfäroider ellerneurosfärer 3, som efterliknar beteendet hos vuxna däggdjur neurala stamceller5. Omfattande sida vid sida jämförelse av primära GBM celler odlas i antingen neurosfär medium kompletteras med tillväxtfaktorer (NMGF) eller i det traditionella tillväxtmediet kompletteras med 10% FBS, visade att GBM neurosfärer var tumorigenic, presenterade multilineage differentiering potential och bevarade genotypen av den ursprungliga tumör, i motsats till 10% FBS kulturer som inte var tumorigenic vid låga passager och avsevärt avvek från de ursprungliga tumörer vid sena passager4.
Isolering av CSC från dissociated GBM tumörer genom cell sortering baserat på uttryck av förmodade CSC markör CD133 har också föreslagits6,7, men ytterligare arbete anges att CSC fenotyp inte definitivt är associerad med uttryck av sådanamarkörer 8-10, minska den ursprungliga entusiasmen för denna strategi, medan nya markörer fortfarande testas10. Den otillgänglighet hittills av en validerad uppsättning markörer som definierar CSC, tillsammans med målet med storskalig förstärkning av dessa celler för prekliniska studier, gör användningen av cellsortering opraktisk för rutinmässiga CSC-berikade kulturer. GBM-celler som valts av förmågan att växa som neurosfärer i NMGF uttrycker alltid neurala stamcellsmarkörer. Vi har observerat att Sox2 och nestin uttrycks allestädes närvarande i neurosfärkulturer, medan CD133 protein finns i en delmängd av GBM neurosfärer (opublicerade data och referens11).
Flera laboratorier bedriver neurosfärkulturer från glioblastomtumörer med samma allmänna tillvägagångssätt för enzymatisk dissociation och odling i serumfritt medium kompletterat medtillväxtfaktorer 3,4,11-14, medan andra kollegor har rapporterat försök att växa långsiktiga neurosfärkulturer från GBM-prover utan framgång . Den allmänna metoden för enzymatisk dissociation och neurosfärkultur av höggradiga gliom som presenteras här liknar vad som har beskrivits i ovanstående publikationer. Vi har optimerat protokollet baserat på vår erfarenhet av att skilja och odla över 100 GBM-prover. Effektiviteten av att få långsiktiga neurosfärkulturer från färska GBM-prover som tillämpar protokollet som presenteras här är över 40%, liknande de få rapporter som visar effektivitetsdata3,15, vilket leder till utforskning av alternativa protokoll som odlingsceller kontinuerligt eller intermittent i serumfritt medium i närvaro av EGF och bFGF som monoskikt på ytor belagda med ECM-protein16,17. Neurosfärkulturer är fortfarande det mest validerade och alltmer populära tillvägagångssättet för att bevara GBM-tumörer molekylära egenskaper och tumörogen potential3,4,11-14, så vårt tillvägagångssätt är att försöka neurosfärkulturer först, samtidigt som vi samtidigt testar alternativa metoder för odling av GBM-celler som inte bildar långsiktiga självförnyande neurosfärer (Figur 1), för att öka representationen av GBM-tumörer som kan användas i djurmodeller. Här presenterar vi ett protokoll för odling av neurosfärer från GBMs. För celler som inte bildar neurosfärer visar vi en enkel modifiering i tillväxtmediet, som det första försöket att odla tumörogena celler från nonneurosfären som bildar GBMs, med lovande resultat och fortfarande genomgår omfattande validering.
Korrekt enzymatisk tumör cell dissociation är ett kritiskt steg i detta protokoll. Vävnaden skall malas väl före inkubation i celldisociationslösning vid 37 °C under rotation, i minst 30 minuter, när vävnaden måste tritureras mekaniskt och utökningen av dissociationen kontrolleras. Beroende på graden av vävnadssammanhållning kan inkubation förlängas med ytterligare 15-30 min, efter behov för att slutföra dissociationen till enstaka celler. Inkubation i dissociationslösning längre än 1 timme rekommenderas inte på grund av minskad cell livskraft. Även om den optimala mängden startvävnad är 200-500 mg, detta protokoll har lett till framgångsrika neurosfär kulturer från så lite som 50 mg tumörvävnad.
Serumfri NMGF är ett selektivt medium, och en procentandel neoplastiska celler som utgör huvuddelen av tumören, liksom värdceller, kommer inte att överleva, medan andra kommer att fästa vid den vävnadskulturbehandlade kolven efter plätering. Det är viktigt att de neurosfärer som kommer att bildas under 1-3 veckor (figur 1B-E) överförs till färska flaskor, för att separera från differentierade tumörceller och skräp.
GBM-celler enzymatically dissociated och aldrig odlas (steg 1.10) kan cryopreserved som en backup källa av celler till kultur i alternativa medier, om neurosfärkulturen misslyckas. Vi har framgångsrikt erhållit neurosfärkulturer från sådana frysta lager, liksom monolayerceller som växer i 2% FBS / NMGF.
Konceptuellt är “cancerstamcell” ett pågående arbete och detta framväxande område kommer att dra nytta av ytterligare klargöranden, eftersom de kliniska konsekvenserna är betydande, särskilt i generationen av tumör heterogenitet, plasticitet och resistens mot terapi19,20. Förutom att vara avgörande för att generera patientspecifika GBM-djurmodeller är neurosfärkulturerna också värdefulla för in vitro-studier som förändring i cellsignalering och genuttryck som svar på tillväxtfaktorer, hypoxi och farmakologiska medel11,21. Vi har valt att använda tvärsnitt av formalin fasta och paraffin inbäddade neurosfärer, bevara 3D-arkitekturen, studera proteinuttryck och post-translationella modifieringar av immunohistokemi11, på grund av överlägsen subcellulär lokalisering i förhållande till den vanligare metoden för märkning och avbildning av hela sfären.
Det har visat sig att inte alla celler i neurosfärer som härrör från vuxna däggdjurshjärnor är stamceller22. På samma sätt är neurosfärerna som odlas från GBM-tumörer sannolikt inte kloniga, på grund av närvaron av mer differentierade cancerprogenitorceller och självaggregering, känd för att uppstå vid höga celltätheter23, vilket anses vara en begränsning av denna metod av vissa. För att gynna berikning för långsiktiga självförnyande stamceller, i motsats till bara stamceller som kan växa tillfälligt somneurosfärer 22, är de primära neurosfärerna dissocierade för sekundär neurosfärbildning och vidare passagede i minst 10 passager, ungefär motsvarande 2 månader i kontinuerlig kultur, vilket är en indikation på en befolkning berikad istamceller 22. Enligt vår erfarenhet kan GBM neurosfärkulturer som uppnår det märket fortsätta att utökas som neurosfärer på obestämd tid. Tumör kvalitet spelar roll, eftersom vi har fått framgångsrika kulturer från GBMs och anaplastic astrocytomas, WHO klass IV respektive III, men inte från lägre kvalitet gliomas.
Den vanligaste metoden för odling av glioblastomceller, i traditionellt tillväxtmedium kompletterat med 10% FBS, leder till betydande genomisk och fenotypisk divergens från de ursprungliga tumörerna 4. Å andra sidan är neurosfärkulturer en stabil och långsiktig källa till celler som presenterar cancerstamcells fenotyp4. Neurosfärmetoden har blivit alltmer populär för berikning av CSC i långsiktiga kulturer för ortopiska mus xenograft modeller, trots att inte lyckas för alla hög kvalitet astrocytoma prover, vilket representerar den största svagheten i denna metod. Studier för att förstå hur molekylära egenskaper hos föräldratumörerna kan påverka neurosfärbildningen pågår. Utforskning av praktiska alternativa metoder för kultur av hög kvalitet gliomas, följt av omfattande validering beviljas, med tanke på de viktiga fördelarna med att ha patientspecifika GBM-modeller, när vi går in i en era av personlig medicin, drivs av tillgängligheten av “omics” information och ökat antal potentiella riktade terapier.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |