Órgãos das plantas aéreas são protegidos pela cutícula, uma assembléia biopoliéster cera supramolecular. Apresentamos protocolos para monitorar a remoção seletiva de epi-e ceras intracuticular de cutículas dos frutos do tomateiro em escalas moleculares e micro por RMN de estado sólido e microscopia de força atômica, respectivamente, e para avaliar a capacidade de ligação cruzada de engenharia biopolyesters cuticulares.
A cutícula, uma camada hidrofóbica protecção sobre as partes aéreas das plantas terrestres, funciona como uma barreira versátil defensiva para vários estresses e também regula o fluxo de água a partir do ambiente externo. 1 Um biopoliéster (cutina) e de cadeia longa de ácidos gordos ( ceras) formam o quadro estrutural principal da cutícula; a integridade funcional da camada cuticular depende da camada exterior 'epicuticular', bem como a mistura consistindo do biopolímero cutina e 'intracuticular dos ceras Nisto 2, nós descrevemos um protocolo global. para extrair ceras exaustivamente de tomate comercial (Solanum lycopersicum) cutículas de frutas ou para remover ceras e intracuticular seqüencialmente e, seletivamente, a partir do composto cutícula. O método de Jetter e Schaffer (2001) foi adaptado para a extracção por passos de ceras e intracuticular da cutícula fruta. 3,4 Para monitorizar oprocesso de remoção de cera seqüencial, de estado sólido polarização cruzada no ângulo mágico de fiação (CPMAS) 13 C espectroscopia de RMN foi utilizado em paralelo com microscopia de força atômica (AFM), oferecendo em nível molecular perfis estruturais dos materiais a granel, complementados por informações sobre a topografia microescala e rugosidade das superfícies cuticulares. Para avaliar as capacidades de ligação cruzada de cutículas desparafinados de cultivadas do tipo selvagem e de um único gene frutos de tomate mutantes, 13 MAS C RMN foi utilizado para comparar as proporções relativas dos alifático oxigenada (CHO e CH2O) porções químicas.
Desparafinação exaustiva por extracção de Soxhlet stepwise com um painel de solventes de diferentes polaridades proporciona um meio eficaz para isolar porções de cera com base nas características hidrofóbicas da sua alifáticos e constituintes aromáticos, preservando a estrutura química do biopoliéster cutina. A extração mecânica de ceras epicuticulares e Seleremoção de ceras ctive intracuticular, quando monitorizado por metodologias complementares físicas, proporciona um meio sem precedentes para investigar a montagem cutícula: esta abordagem revela que a organização supramolecular e integração estrutural de vários tipos de ceras, a arquitectura da matriz cutina cera, e do produto químico composição de cada constituinte. Além disso, de estado sólido 13 C RMN revela diferenças nos números relativos de CHO e 2 CH porções químicas O para tipo selvagem e mutante vermelhos maduros frutos de tomate. As técnicas de RMN oferecem ferramentas excepcionais para a impressão digital do estrutura molecular dos materiais cuticulares que são insolúveis, amorfo, e quimicamente heterogénea. Como técnica de imagem não invasivo superfície seletiva, AFM fornece um meio eficaz e direta para investigar a organização estrutural do conjunto cuticular na escala de comprimento nm m de.
Os protocolos aqui descritos permitem a caracterização molecular e microescala detalhada de um material vegetal complexo insolúvel sem a necessidade de decomposição química destrutiva. Para investigar a mistura do biopoliéster cutina com diversos lípidos (ceras) que controlam a organização estrutural do conjunto cuticular, 10 realizamos e monitorados procedimentos para a remoção seletiva de ceras epicuticulares e intracuticular de uma mistura heterogênea cuticular. De estado sólido 13 C RMN foi utilizado para medir a extracção de componentes de cera moleculares, e microscopia de força atómica serviu para examinar as alterações concomitantes na rugosidade da superfície. 6,11 Para comparar as capacidades de ligação cruzada de cutins de cultivada de tipo selvagem e único gene frutos de tomate mutantes, de estado sólido 13 C RMN foi também utilizada para estimar os números relativos de CHO e 2 CH porções O químicos.
Uma série de característica de projetos deste protocolo são notáveis. À medida que os materiais de cera englobar uma grande variedade de lipidos, tratando a cutícula de frutas com uma série de solventes com polaridades divergentes é essencial para alcançar desparafinação exaustiva. Além disso, o tempo de desparafinagem pode variar de 8 horas a 24 horas, dependendo da natureza das amostras cutícula. Para extrair ceras consistentemente a partir da cutícula fruto intacto, é imperativo para aplicar o revestimento adesivo uniforme para a superfície.
De estado sólido CPMAS 13 C RMN 12 é um método rápido para a identificação de qualitativa vários componentes estruturais de biopolímeros vegetais altamente heterogéneos e insolúvel conservando as suas características físicas nativas; 13 RMN solução de estado-tradicional também pode ser usado para caracterizar as misturas de cera extraídos. Se a estimativa quantitativa de grupos funcionais é desejada para os polímeros de plantas intactas, 5 de alta fidelidade de polarização direta magia ângulo de giro (DAMPs) 13 C RMN 5,14 deve ser utilizado como um método complementar. Quantificação precisa dos grupos funcionais requer cuidadosa otimização dos tempos de reciclagem, comprimentos de pulso de excitação, e no poder de dissociação heteronuclear 15. Dissociação O heteronuclear pode ser ajustado para uma intensidade de campo 1 H variando de 50 kHz a 185 kHz usando o TPPM 16 ou COLUNA 7 metodologias. Em adição a estes parâmetros, a sensibilidade das medições CPMAS depende do tempo de spin-lock e Hartmann-Hahn condição de correspondência. 15 Em lugar de CPMAS tradicionais, uma rampa de amplitude CP técnica (RAMP-CP) pode ser implementado para maximizar a cruz -polarização eficiência através da variação da amplitude 1 H linearmente (~ 20-50%) ou tangencialmente ao mesmo tempo manter a amplitude da força do campo 13 C constante durante o período de rotação de bloqueio-(ou vice-versa). 17,18 execução das medições CPMAS em um mínimo de duas ro diferentetor-fiação freqüências é imperativo distinguir bandas laterais fiação dos principais picos espectrais.
Medições simultâneas de AFM realizadas no modo de contato permitir imagens diretas do estado da superfície da cutícula com velocidades de digitalização de alta e alta resolução, 19, por exemplo durante a remoção sequencial de componentes cerosos. Operando AFM no aproveitamento (não-contacto) modo pode ser usado como uma alternativa para a caracterização da superfície de delicadas "leves" de materiais vegetais, evitando danos possível devido à laterais (cisalhamento) forças e raspagem da superfície da amostra. 5,20 Em ambos os casos , a aquisição seqüencial de várias imagens do mesmo ponto da superfície serve para identificar qualquer dano na superfície devido a "sonda de superfície interações" nas medidas de AFM. 6,21 Para reprodutibilidade ideal, sondas AFM com constantes de mola adequados para superfícies suaves cuticulares deve ser usado, constância e da temperatura e da umidade deve ser mantida. 6,15,20 </sup> Considerando solid-state NMR oferece um perfil molecular de ensemble médio (a granel) em propriedades cutículas dos frutos do tomateiro, a imagem de força atômica fornece uma sonda complementar não invasivo 22,23 para acompanhar a topografia da superfície destes conjuntos macromoleculares requintadamente complexos 1,2.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation EUA concede # MCB-0741914 e 0843627-MCB; apoio de infra-estrutura adicional foi fornecida no City College de Nova York pelo National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos. Agradecemos o JKC Rose grupo no Departamento de Biologia Vegetal da Universidade de Cornell para a prestação de M82 (tipo selvagem) e CM15 (mutante) cutículas de tomate. Agradecemos ao Dr. Spyros Monastiriotis do grupo CCNY Engenharia Química do Prof Alexander Couzis por sua generosa ajuda com os experimentos de AFM. Agradecemos a Sra. Lauren Gohara de apoio design gráfico.
Name of the reagent | Company | Catalog no. | Comments |
Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
Incubator/shaker | New Brunswick Scientific Co. | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
Variac Controller | |||
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR | 89056 | |
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR | 28320 | |
Methanol | VWR | EMD-MX0485-7 | |
Glass wool | VWR | RK20789 | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | |
Tweezers | VWR | 82027-452 | |
Chloroform | VWR | EM-CX1050-1 | |
Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
Nitrogen gas | |||
Parafilm | VWR | 52858 | |
Paper towels | VWR | 89002-984 | |
Kim wipes | VWR | 21905-026 | |
Gum arabic | Sigma | G9752 | |
1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian (Agilent) | ||
NMR spectrometer | Varian 600 NMRS | standard bore magnet | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments (Bruker AXS) | ||
Nanoscope software | Digital Instruments (Bruker AXS) | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco (Bruker AXS) | Model NP-20 | |
Light microscope | Digital Instruments | ||
Magnetic puck | Digital Instruments | ||
Double sided tape | VWR | ||
Fruit Peeler | |||
Büchner funnel | VWR | 89038 |