العزلة ودراسة البيوفيزيائية البشرة من الفاكهة
Summary
محمية أجهزة محطة جوية من إهاب، وهو supramolecular biopolyester الشمع الجمعية. نقدم بروتوكولات لرصد إزالة الانتقائي للبرنامج الموسع للتمنيع، والشموع intracuticular البشرة من ثمرة الطماطم على مقاييس الجزيئية ومتناهية الصغر من قبل الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي ومجهر القوة الذرية، على التوالي، وتقييم القدرات عبر ربط biopolyesters جليدية هندسيا.
Abstract
إهاب، طبقة واقية مسعور على الأجزاء الهوائية من النباتات البرية ووظائفها، وحاجز دفاعي متعدد الاستعمالات لمختلف الضغوط الحيوية وغير الحيوية، وتنظم أيضا تدفق المياه من البيئة الخارجية. 1 A biopolyester (كوتين)، وسلسلة طويلة من الأحماض الدهنية ( الشموع) تشكل الإطار الأساسي الهيكلي للبشرة، والنزاهة الوظيفية للطبقة جليدية يعتمد على الطبقة الخارجية لل'epicuticular "، فضلا عن مزيج يتكون من البوليمر الحيوي كوتين و" intracuticular' الشموع 2 وهنا، نحن تصف وضع بروتوكول شامل. لاستخراج الشمع شاملة من الطماطم التجارية (مغد lycopersicum) البشرة فاكهة أو لإزالة الشمع وepicuticular intracuticular بالتتابع وبشكل انتقائي من مركب بشرة. تم تعديل طريقة Jetter وشافر (2001) لاستخراج متدرج من الشموع epicuticular وintracuticular من بشرة الفاكهة. 3،4 لمراقبةعملية إزالة الشمع متتابعة، الحالة الصلبة عبر الاستقطاب سحر الزاوية الغزل (CPMAS) 13 C تم استخدام الرنين المغناطيسي الطيفي بالتوازي مع مجهر القوة الذرية (فؤاد)، وتوفير المستوى الجزيئي الملامح الهيكلية للمواد السائبة تستكمل المعلومات عن تضاريس الميكروسكيل وخشونة السطوح جليدية. لتقييم قدرات عبر ربط البشرة dewaxed من المزروعة والبرية من نوع واحد الجينات الطافرة ثمار الطماطم، واستخدمت MAS 13 C NMR للمقارنة بين النسب النسبية لالأليفاتية الاوكسيجين (CHO وCH 2 O) الأنصاف الكيميائية.
dewaxing شاملة من قبل استخلاص Soxhlet متدرج مع لجنة من المذيبات متفاوتة قطبية يوفر وسيلة فعالة لعزل الأنصاف الشمع على أساس الخصائص مسعور من الأليفاتية والعطرية، مع الحفاظ على التركيبة الكيميائية للbiopolyester كوتين. استخراج الميكانيكية من الشموع epicuticular وسيليإزالة الشمع من ctive intracuticular، عندما ترصدها منهجيات بدنية تكميلية، ويوفر وسيلة غير مسبوقة للتحقيق في الجمعية إهاب: هذا نهج يكشف عن تنظيم supramolecular والتكامل الهيكلي لأنواع مختلفة من الشموع، والهندسة المعمارية من المصفوفة كوتين الشمع، والكيميائية لل تكوين كل التأسيسية. وبالإضافة إلى ذلك، الحالة الصلبة 13 C NMR يكشف عن اختلافات في الأعداد النسبية للCHO والكيميائية CH الأنصاف O 2 لمن النوع البري ومتحولة الحمراء ثمار الطماطم الناضجة. تقنيات الرنين المغناطيسي تقدم أدوات استثنائية لبصمة التركيب الجزيئي للمواد التي هي غير قابلة للذوبان جليدية، غير متبلور، وغير المتجانسة كيميائيا. كأسلوب موسع التصوير السطحي الانتقائي، فؤاد يوفر وسيلة فعالة ومباشرة للتحقيق في التنظيم الهيكلي للجمعية جليدية على مقياس طول نانومتر ميكرون.
Protocol
Discussion
وصف البروتوكولات تسمح الوثيقة للمفصل التوصيف الجزيئي والميكروسكيل من المواد النباتية المستعصية المعقدة دون الحاجة إلى انهيار الكيميائية المدمرة. للتحقيق في المزج بين biopolyester كوتين مع الدهون المختلفة (الشموع) التي تتحكم في التنظيم الهيكلي للجمعية جليدية، 10 اجريناه ورصد الإجراءات لإزالة انتقائية من الشموع epicuticular وintracuticular من مزيج من جليدية غير المتجانسة. واستخدمت الحالة الصلبة 13 C NMR لقياس استخراج مكونات الشمع الجزيئية، وذرية المجهر قوة عمل لدراسة التغيرات المصاحبة في خشونة السطح. 6،11 لمقارنة القدرات عبر ربط cutins من الجينات المزروعة واحدة من النوع البري و ثمار الطماطم متحولة، كما تم استخدام الحالة الصلبة 13 C NMR لتقدير الأعداد النسبية للCHO وCH 2 الأنصاف يا الكيميائية.
وهناك عدد من ميزة تصميمق من هذا البروتوكول جديرة بالملاحظة. كما تشمل المواد الشمع مجموعة واسعة من الدهون، وعلاج بشرة الفاكهة مع سلسلة من المذيبات وجود أقطاب متنافرة أمر ضروري لتحقيق dewaxing شاملة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف من وقت dewaxing 8 ساعات إلى 24 ساعة تبعا لطبيعة العينات بشرة. لاستخراج الشمع epicuticular باستمرار من إهاب فاكهة سليمة، لا بد من تطبيق طلاء لاصق بشكل موحد على السطح.
الحالة الصلبة CPMAS 13 C NMR 12 هو طريقة سريعة لتحديد نوعية مكونات هيكلية مختلفة من البوليمرات الحيوية النباتية غير متجانسة للغاية وغير قابلة للذوبان مع الحفاظ على خصائصها الفيزيائية الأصلية، ويمكن أيضا 13 التقليدية حل الدولة الرنين المغناطيسي النووي يمكن استخدامها لوصف خليط من الشمع المستخرج. إذا كان المطلوب تقدير كمي للجماعات وظيفية للبوليمرات مصنع سليمة، 5 عالية الدقة المباشر الاستقطاب سحر الزاوية الغزل (DPMAS) 13 C وينبغي استخدام الرنين المغناطيسي النووي 5،14 كوسيلة تكميلية. تحديد الكميات الدقيقة من المجموعات الوظيفية يتطلب التحسين دقيق مرات إعادة تدوير، وأطوال نبض الإثارة، وقوة فصل heteronuclear. يمكن تعيين 15 وفصل heteronuclear لقوة 1 حقل H تتراوح بين 50 كيلو هرتز إلى 185 كيلو هرتز باستخدام TPPM 16 أو في العمود الفقري 7 المنهجيات. وبالإضافة إلى هذه المعايير، وحساسية من قياسات CPMAS يعتمد على الوقت تدور القفل وهارتمان، هان حالة مطابقة. (15) وفي مكان CPMAS التقليدية، ويمكن تنفيذ المنحدرة، سعة CP (RAMP-CP) تقنية لتعظيم الصليب القطبية الكفاءة من خلال تغيير السعة H 1 خطيا (~ 20-50٪) أو هامشية مع الحفاظ على السعة من 13 قوة الحقل C مستمر خلال الفترة تدور القفل (أو العكس). 17،18 إجراء القياسات في CPMAS ما لا يقل عن 2 ر مختلفةتور الغزل الترددات لا بد من التمييز بين sidebands الغزل من قمم الطيفية الرئيسية.
المتزامنة قياسات AFM التي أجريت في وضع الاتصال تمكين التصوير المباشر لحالة سطح بشرة بسرعات المسح العالية وارتفاع القرار، و 19 على سبيل المثال خلال إزالة متتابعة من مكونات شمعية. فؤاد العاملة في التنصت على (عدم الاتصال) ويمكن استخدام طريقة كبديل لتوصيف سطح "لينة" حساسة المواد النباتية، وتجنب الأضرار المحتملة نتيجة للقوات (القص) الجانبية وتجريف سطح العينة. 5،20 في كلتا الحالتين ، واقتناء متتابعة من صور متعددة من نفس البقعة على السطح يعمل على تحديد أي ضرر السطح بسبب "التفاعلات مسبار على سطح" في قياسات AFM. 6،21 للحصول على استنساخ الأمثل، يجب أن تحقيقات فؤاد مع الثوابت ربيع مناسبة للأسطح جليدية الناعمة لن تكون ينبغي الحفاظ على استخدامها، وثبات درجة الحرارة والرطوبة. 6،15،20 </sيصل> بينما الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي يقدم لمحة الجزيئي للمتوسط الفرقة (بالجملة) في خصائص البشرة ثمرة الطماطم، والتصوير الذري يوفر قوة تحقيق موسع 22،23 مكمل لتتبع تضاريس سطح هذه التجمعات الجزيئات المعقدة بشكل رائع. 1،2
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الولايات المتحدة الوطنية للمنح مؤسسة العلوم # MCB-0741914 و 0843627 MCB؛ وقدم دعم البنية التحتية إضافية في كلية مدينة نيويورك من قبل المعاهد الوطنية للصحة 2 G12 RR03060-26 من المركز الوطني للبحوث الموارد. نحن نعترف بامتنان JKC روز مجموعة في قسم جامعة كورنيل بيولوجيا النبات لتوفير M82 (نوع البرية) وCM15 (المسخ) البشرة الطماطم. نشكر الدكتور سبيروس Monastiriotis من مجموعة الهندسة الكيميائية حقائق عجيبة البروفيسور الكسندر Couzis لمساعدته السخية مع التجارب فؤاد. نحن نشكر السيدة لورين الجوهره للحصول على دعم تصميم الرسوم البيانية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog no. | Comments |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
| Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
| Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
| Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
| Incubator/shaker | New Brunswick Scientific Co. | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
| Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
| Variac Controller | |||
| Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR | 89056 | |
| Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR | 28320 | |
| Methanol | VWR | EMD-MX0485-7 | |
| Glass wool | VWR | RK20789 | |
| Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | |
| Tweezers | VWR | 82027-452 | |
| Chloroform | VWR | EM-CX1050-1 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| Nitrogen gas | |||
| Parafilm | VWR | 52858 | |
| Paper towels | VWR | 89002-984 | |
| Kim wipes | VWR | 21905-026 | |
| Gum arabic | Sigma | G9752 | |
| 1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian (Agilent) | ||
| NMR spectrometer | Varian 600 NMRS | standard bore magnet | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
| Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
| Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments (Bruker AXS) | ||
| Nanoscope software | Digital Instruments (Bruker AXS) | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
| AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco (Bruker AXS) | Model NP-20 | |
| Light microscope | Digital Instruments | ||
| Magnetic puck | Digital Instruments | ||
| Double sided tape | VWR | ||
| Fruit Peeler | |||
| Büchner funnel | VWR | 89038 |
Referenzen
- Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
- Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes – a smart material?. Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
- Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
- Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
- Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
- Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
- Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
- Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
- Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
- Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
- Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
- Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
- Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
- Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
- Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
- Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids. J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).
- Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR. J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).
- Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization – Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
- lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
- Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
- Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemie. 47, 7986-7998 (2008).
- Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).
