분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

1. 토마토의 효소 고립은 5 손톱 그릇에 여러 상업적 또는 경지 토마토를 놓습니다. 큰 섹션 과일의 피부 보지, 내부 과피 조직을 버리고. 탈이온수와 토마토 스킨을 씻고 비이커에 물 속에 그들을 보존. 200 ML 추가, 나트륨 아세테이트 trihydrate의 1.22 G (M r에. 136.08 g / 몰)와 비커에서 2.34 ML 빙초산 (17.485 M)를 넣어 50 밀리미터 산도 4.0 아세트산 나트륨 버퍼를 (° C 31에서) 준비 31 살에 4.0으로 산도를 조정 후 탈이온수, 그리고 ° C. , 13 밀리그램 할머니 3;, cellulase의 0.2 G (1.3 단위 / MG 고체, 시그마 알드리치 EC 232.734.4); pectinase (10 U ML -1, TCI 미국 EC 3.2.1.15) 4 ML을 포함하는 혼합물을 준비한다 그리고 최종 효소 칵테일 200 ML을 얻기 위해 효소 혼합물에 아세트산 나트륨 버퍼의 196 ML에 추가합니다. 5 완전히 효소 칵테일 벗겨 토마토 껍질을 담가과 부화31 살에 ° 일정한 진동 (G24 환경 보육 흔드는, 뉴 브 런 즈윅 과학 주식 회사)와 24 시간 동안 C #. 주방 스트레이너 또는 Büchner 유입 경로 및 탈이온수 그들을 씻어을 사용하여 토마토 스킨을 수집합니다. 이후, 1 시간 동안 실온에서 진공 오븐에서 그들을 넣습니다. 이후 dewaxing 수속 라벨과 공을 병에 말린 토마토 스킨을 보존. 2. Soxhlet 추출 6 시까지 철저한 Dewaxing 철저한 dewaxing에 사용되는 장비는 열원 (가열 맨틀과 Variac 컨트롤러), 용매 저수지에 대한 둥근 바닥 플라스크, Soxhlet 추출기, 소결 유리 골무 또는 일회용 추출 골무, 안티 지원해주 칩 콘덴서 (그림 참조로 구성되어 있습니다. 1). 좁은 사이펀 암 (부품 그림 6 및 7. 1)주의 취급을 필요로하는, 매우 섬세하고 파손하는 경향이있다합니다. (에서 얻어진 토마토 피부의 0.5-1 g을 넣고절구 1 단계.), 그리고 샘플 AFM 측정 (5 항)에 사용할 수없는 한 유봉과 거친 분말로 샘플을 갈다. 샘플로 약 절반을 소결 – 유리 또는 일회용 골무를 작성하고 추출 열의 기지에 신중을 배치 핀셋을 사용합니다. 콘덴서를 부착하고 알루미늄 호일로 싸서. 몇 반 지원해주 칩의 면전에서 메탄올 용매 (ACS 학년)를 가열 플라스크의 벽에 그것이 부드럽게 종기와 refluxes까지. 글라스 울과 알루미늄 호일을 모두 가진 용매 저수지를 커버. 골무가 가득 차면 Soxhlet 장치 내에 저수지는 초당 약 드롭을 축적하도록 Variac 전압을 조정하고 몰래, 1 시간 동안 프로세스가 발생합니다 확인합니다. 12 H의 추출 과정을 계속 다음 가열 맨틀을 절감하고 장치가 식다 수 있습니다. 용매 처분하기위한 하나의 단위로 추출기와 저수지를 제거합니다. 핀셋을 사용RS는 불과 추출 열의 목 아래 골무를 높이 그것의 용매 초과 드레인, 그리고 깨끗한 표면에 골무을 배치합니다. 아래 플라스크에 몰래 있도록 추출 컬럼을 기울이십시오. 술병을 분리하고 분류 폐기물 용매 콘센트에 폐기물을 붓는다. 점차적으로 감소 극성, 각각의 경우 12 H에 대한 예, 클로로포름과 헥산의 연속 용매에 대한 단계 2.3 및 2.4를 반복합니다. 토마토 cutin 예제 골무 내부 역시 그 위에 질소 가스의 흐름을 폭파하거나 실온에서 진공 오븐에 넣어 의한 건조하도록 허용합니다. 마지막으로, 건조한 시료의 질량을 측정하고 parafilm으로 봉인 나사 최고 항아리에 실온에서 보관. 3. Epicuticular 및 Intracuticular 왁스 3,4의 선택적 분리 첫째, 증류수로 전체 토마토 (1에서 설명과는 토마토 별도의 배치.) 씻는다. 아빠와 함께 그들을 말리어 수건과 Kimwipes, 장소 그들을 알루미늄 호일의 조각을 아래로 줄기. 1백20퍼센트 (W / W, 대량 비율) 패션 아래 상단에있는 아라비아 고무 수용액으로 전체 토마토를 바르고 얇은 필름을 떠나는 과일의 피부에 건조를 아랍어 껌를위한 한 시간 정도 허용합니다. 하지 찔린 토마토 피부에 신중하다고, 족집게를 사용하여이 필름을 제거합니다. 한 번 더 절차를 반복합니다. 3 분 1시 1분 (V / V) 클로로포름 – 물과 혼합을 포함하는 튜브에 필름을 추가합니다. 격렬한 교반 및 위상 분리 후, 클로로포름 분수를 피펫과 epicuticular 왁스를 떠나, 별도의 덮개가 튜브 안에 그들을 증발. 토마토는 물리적으로 그대로 유지됩니다. 상온에서 2 분 동안 클로로포름으로 그들을 찍어와 용매를 증발 후 intracuticular 왁스를 수집합니다. 이제 토마토 껍질과 (와 같은 설명에 각각 셀룰로오스 및 펙틴을 제거 (아세트산 나트륨 완충액의 cellulase와 pectinase 포함) 효소를 취급 <str긴 사연> 1). 원하는 경우 다양한 극성 세 용제를 (각각 메탄올, 클로로포름과 헥산,)를 사용하여, (단계 2 참조) Soxhlet 추출하여 이러한 효소 격리된 손톱에 든다 dewaxing을 수행합니다. 4. 교차 편광에 의한 토마토 과일 Cutin의 분자 특성화 매직 앵글 회전 고체 핵 자기 공명 (CPMAS ssNMR) 6 공급 업체 제공 포장 도구를 사용하여 1.6 mm fastMAS 지르코니아 로터의 완전 dewaxed 토마토 손톱 (cutins) 장소 4-6 밀리그램. (지상 dewaxed 토마토 손톱 또는 일부 dewaxed 손톱의 아주 작은 조각 하나에 적합합니다.) 로터에 너무 밀접하게 샘플이 균일하게 포장되었는지 확인하지만. 상단 모자를 씌우고 후, 스핀 속도의 측정을 용이하게하기 위해 검정색 잉크 마커 펜으로 캡의 절반을 그리다. 절반 높이에서 최소 스펙트럼 선폭을위한 NMR 분광계의 shimming 조정ND는 양성자 (1 H)을 교정하고 탄소 (13 C) 90 같은 adamantane 같은 표준 화합물을 사용 ° 펄스 폭을. 모델 화합물로 글리신이나 글루타민을 사용 (하트만-돼야 해 한이 일치하는 전력 레벨, 1 H – 13 C 접촉 시간, 헤테로핵 1 H 감결합 강도) 모든 매개 변수를 최적화하여 최대 신호 강도를 얻을 교차 편광 마술 – 각도 회전의 (CPMAS) 실험. 600 MHz의의 1 H 주파수에서 얻은 스펙트럼을 권장 조건은 10 kHz에서 15 kHz에서 회전 주파수, 인수 사이에 3 초 지연, 그리고 185 kHz에서의 주파수에 상응하는 자기장 강도에서 7 감결합 척추 헤테로핵 양성자를 포함합니다. probe에 cutin – 팩킹된 로터를 삽입합니다. 그런 다음 자석으로 프로브를 놓습니다. 점차적으로 좋은 샘플 포장 및 로터의 안정성을 확인하기 위해 최대 10 kHz에서까지 회전 속도를 높이십시오. 회전자의 최종 회전 안정성 내에서 확인± 20 Hz에서. 튜닝 조정과 프로브의 콘덴서와 일치하는 것은 iteratively 1 H와 13 C NMR 주파수 모두에서 최소 전력 반사를 얻을 수 있습니다. 25 실험 온도를 설정합니다 ° C (또는 상온). 10 kHz에서 회전 주파수에서 결정 하트만-돼야 해 한이 검색 조건에 해당하는 미리 최적화된 CPMAS 실험을 시작합니다. 지수 (Lorentzian) 라인 50-100 Hz의 확대와 함께 4096 과도, 조건 스펙트럼을 습득하고, 푸리에는 신호 강도 대 화학 차폐 (PPM)의 NMR 스펙트럼을 생성하기 위해 변환하지. 표준으로 8 – 13 C 화학은 외부에서 38.4 PPM (-CH 그룹 2)에서 adamantane 세트를 사용하여 교대 참조. 15 kHz에서로 로터 회전 주파수를 증가하고이 후자의 회전 주파수에서 결정 하트만-돼야 해 한이 검색 조건에 해당하는 CPMAS 측정 (단계 4.6-4.8) 반복합니다. Repe자연 (밀랍)과 부분적으로 dewaxed 과일 표피 샘플로 CPMAS 실험 (단계 4.1-4.9)에서. 5. 원자 힘 현미경과 토마토 표피 표면 프로빙 (디지털 인스 트루먼 트의 Nanoscope IIIa을; 절차 현미경 사이에 약간 다릅니다) 6 스캐닝 프로브 현미경 (SPM)를 켭니다 (그림 2)와 현미경 모드 토글 스위치가 접촉 원자 힘 현미경 (AFM) 모드로 설정되어 있는지 확인합니다. 수동으로 두개의 사용자가 조절 가능한 전면 단자를 설정하여 SPM 헤드를 올립니다. 머리 뒤쪽에서 클램핑 스크류를 회전하여 SPM 헤드에서 AFM의 tipholder를 분리합니다. tipholder에서 기존의 AFM의 캔틸레버를 제거하려면 족집게를 사용하여 다음 조심스럽게의 패키지에서 새로운 실리콘 질화물 캔틸레버 (AFM 탐침)을 잡고 옛 캔틸레버의 장소에 설치하십시오. 새로 설치된 AFM의 캔틸레버가 깨진되지 않았는지 확인하기 위해 가벼운 현미경을 사용합니다. 일 첨부전자 토마​​토 표피 샘플 양면 테이프와 스테인레스 스틸 디스크 (샘플 퍽을)까지 (일부 dewaxed 토마토 표피의 섹션 ~ 10mm × 10 밀리). 표피 표면이 평평하고 퍽을에 대한 샘플의 배치 이후 원활한 유지하는지 확인하기 위해 가벼운 현미경을 사용합니다. SPM 스캐너 상단의 자기 지역쪽으로 토마토 표피 샘플로 퍽을를 놓습니다. 손잡이를 회전하여 높은 스캐너의 전면이 수동 조절 나사를 설정하고, 다른 두 전면 나사 등 거의 동일한 수준으로 동력 다시 조정 나사를 설정합니다. 세 개의 나사가 SPM 헤드에 tipholder를 삽입했을 때 AFM 팁을 깨는 피하기 위해 충분히 높게 설정되어 있는지 확인합니다. SPM 헤드에 tipholder를 꽂아과 머리 뒤쪽에 클램핑 스크류를 강화하여 고정하십시오. 레이저 켠 후, 머리 꼭대기에 중앙 (Y)과 오른쪽 (X) 레이저 조정 단자를 사용하여 AFM의 캔틸레버에서 레이저 자리를 맞춥니다.정확히 AFM의 캔틸레버의 끝에 레이저 스폿을 배치하기 위해 종이에 비치는 레이저 광선을 모니터링합니다. 이동식 미러 iteratively 따라서 반사 레이저 빔을는 광검출기의 네 quadrants에 의해 균일하게 수신되고 있도록, 최대 신호 (SUM 신호)를 달성하기 위해 광검출기 조정 단자를 사용하는 위치를 조정합니다. 시각적으로 거꾸로 현미경으로 시료 표면에 대한 AFM 팁의 접근을 모니터링, retracting 수동 조정 전면 나사에 의해 AFM 팁 및 SPM 스캐너의 동력 다시 조정 나사를 낮춥니다. 세 개의 나사가 이미징 기울어진 샘플에서 유물을 피하기 위해 동일한 수준에 있는지 확인합니다. 샘플 대한 팁을 제공하지만, 너무 가까이 그렇지 팁 처리 또는 시료 표면을 뚫고 나옵니다. 이때 레이저 빛이 AFM의 캔틸레버가 광검출기에 이동식 거울에서 반사됩니다 오프 반영. sili와 접촉 AFM 모드죄수 질화 AFM 팁을은 0 V 설정 값과 비교 신호 (수평 / 수직 변화)에 미러의 위치를​​ 조정하여 0 V에 대해 -2 V로 출력 신호 (수직 편향) 전압을 설정합니다. Nanoscope 소프트웨어를 사용하여 현미경 아이콘을 클릭하여 해당 프로필 (접촉 모드 AFM)을 선택합니다. "스캔 컨트롤 설정"패널을 사용하여 스캔 속도와 스캔 크기 예를 들어, 10 미크론 스캔 크기와 2 Hz에서 스캔 속도를 설정합니다. AFM 팁이 관여 – 팁 아이콘을 클릭하여 샘플 표면을 참여하도록 허용합니다. 이것은 샘플 표면을 종사 때까지 SPM 기지 동력 뒤쪽 나사를 조절함으로써, 프로그램은 이제 끝을 낮출 것이다. 제보가 성공적으로 종사되면 검색 프로세스가 자동으로 시작됩니다. iteratively 최고를 달성하는 등 설정점, 적분 게인, 비례 게인, 스캔 크기, 스캔 속도, 선 및 샘플 / 라인과 같은 매개 변수를 조정 소프트웨어의 이미지와 범위 모드를 사용하여 스캔 과정을 모니터링해상도 이미지. 대형 Z 축 범위 (데이터 규모)로 스캔 시작, 다음 조심스럽게 이미지 표면 기능의 최고의 대비를 관찰하는 데이터 스케일 값을 줄일 수 있습니다. 표면 기능의 높이가 가능한 Z 축 범위를 초과하는 것으로 나타났습니다 스캔한 이미지의 흰색 영역의 발생을 최소화합니다. 데이터 파일을 저장하는 이미지를 캡처, 다음 스캔 라인 사이의 오프셋 수직 (Z) 스캐너 드리프트, 이미지 리본, 그리고 수직으로 인해 이미지 아티팩트를 제거하려면 납작 함수를 사용하여 데이터를 처리, 9 결국 평균 거칠기를 계산. 데이터를 저장 후, 그것을 작동하는 데 사용된 컴퓨터 제어 스크류 모터의 동작을 반대하여 AFM 팁을 접어야합니다. 이미지 처리는 오프라인 이미지 분석 모드 및 / 출연하거나 다른 컴퓨터를 사용하는 경우가 있습니다. 스캔 영역의 x와 y 위치를 변경하는 팁 홀더의 전면 하단에 회색의 금속 단자를 사용하여, 그리고 5 샘플 로카에서 측정을 반복tions은 이미지 품질이 세게 나오시면 AFM의 캔틸레버를 교체, 재현성을 확인합니다. 6. 대표 결과 CPMAS 13 C NMR 스펙트럼의 화학 변화 분석 (그림 3)는 철저하게 dewaxed 토마토 표피 (cutin)에있는 주요 기능 그룹을 식별. cutin biopolyester의 주요 탄소 moieties은 긴 사슬 aliphatics (0-45 PPM), 산소 aliphatics (45-110 PPM), 곱하기 – 보세 및 방향족 (110-160 PPM) 및 carbonyls (160-220 것으로 발견되었습니다 PPM). 산소 알킬 moieties은 (CHO + CH 2 O)함으로써 cutin 모체의 분자 구조를 형성 cutin의 생체 고분자의 monomeric 단위 사이에 공유 결합 관계를 확립에 중요한 역할을한다. 45과 100 PPM 사이의 스펙트럼 영역에서 관찰 상대적인 피크 영역의 차이는 돌연변 cutin 교차 링크 성형 CHO structura의 비교적 큰 비중을 가지고하는 것이 좋습니다 난 moieties가에 비해 야생 형 cutin; 직접적인 분극 (DPMAS) NMR 다섯 가지 방법을 사용하여주의 정량 측정이 추론을 지원 (데이터가 표시되지 않음). CPMAS 13 C NMR 스펙트럼은 또한 cutin 생체 고분자의 주요 화학 구조를 유지하면서 cutin-왁스 복합체에서 에피와 intracuticular 왁스의 순차적인 제거를 나타내는, 31 PPM (그림 4)에서 점차적으로 감소 왁스 피크를 보여주었다. 병렬 AFM 이미지 분석 (그림 5) cuticular 어셈블리의 조직 변경을 나타내는, 과일 표피로부터 에피와 intracuticular 왁스의 stepwise 추출에 의한 표면 부정을 공개했다. . 그림 1 Soxhlet 추출기 (이미지 출처 : 위키백과). "/> 그림 2.) 스캐닝 프로브 현미경. B) SPM 헤드 (디지털 인스 트루먼 트에서 제공 AFM 훈련 설명서에서 적응). 그림 3. 야생 – 타입 (M82) 및 돌연변이로부터 철저하게 dewaxed 빨간색으로 익은 토마토 과일 손톱 (cutins)의 150 MHz의 CPMAS 13 C NMR의 스펙트럼은 (CM15) 화학적으로 resonances을 보여주는 교차 연결된 hydroxyfatty 산의 기능 그룹에 해당 옮겨 보겠습니다 기반은 폴리 에스테르와 일부 증식 접착 moieties. 모든 스펙트럼는 10 kHz에서 회전 주파수와 함께 인수했다. 그림 4. 상업 빨간색 익은 토마토 과일 손톱의 150 MHz의 13 CCPMAS NMR의 스펙트럼은 순서대로 아라비아 고무 기계 추출하여 epicuticular 및 intracuticular 왁스의 제거 및 TW시 작곡 변화를 전시O 분 클로로포름 물놀이, 각각. 모든 스펙트럼는 15 kHz에서 회전 주파수와 함께 인수했다. 그림 5. AFM 이미지 및 부분적으로 dewaxed 상업 토마토에 대한 거칠기 견적 epicuticular (왼쪽)와 intracuticular (오른쪽) 왁스의 stepwise 제거 후 그림 4에 설명되어 손톱.