JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

בידוד מחקר Biophysical של cuticles פירות

Published: March 30, 2012
doi:
10.3791/3529
, , , , ,
1Department of Chemistry,City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies, 2Department of Chemical Engineering,City College of New York

Summary

אברי הצמח אוויר מוגנים על ידי לציפורן, הרכבה סופראמולקולרית biopolyester שעווה. אנו מציגים פרוטוקולים כדי לפקח על הסרת סלקטיבי של EPI-ושעוות intracuticular מ cuticles פירות עגבניות על סולמות מולקולרית מיקרו ידי NMR מצב מוצק וכן במיקרוסקופ כוח אטומי, בהתאמה, על מנת להעריך את יכולת cross-linking של biopolyesters cuticular מהונדסים.

Abstract

לציפורן, שכבת מגן הידרופובי על החלקים אוויר של הצמחים היבשתיים, משמש כמחסום מגן צדדי מדגיש ביוטיים אביוטי שונים וכן מסדיר זרימת מים מן הסביבה החיצונית. 1 biopolyester (cutin) וארוך (שרשרת חומצות שומן שעוות) יוצרים את המסגרת המבנית העיקרית של לציפורן, על שלמות תפקודית של שכבת cuticular תלוי השכבה החיצונית "epicuticular", כמו גם את תערובת המורכבת biopolymer cutin ו 'intracuticular של שעוות 2 במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקול מקיף. כדי לחלץ שעוות ממצה של עגבניות מסחרי (Solanum lycopersicum) cuticles פירות או להסיר שעווה epicuticular ו intracuticular ברצף סלקטיבי מורכב מ לציפורן. השיטה של Jetter ו שפר (2001) הותאם להפקת בשלבים של שעוות epicuticular ו intracuticular מ לציפורן פירות. 3,4 כדי לפקח עלתהליך של הסרת שעווה רציף, מצב מוצק בין הקיטוב קסם זווית-ספינינג (CPMAS) 13 C NMR ספקטרוסקופיה שימש במקביל במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מתן מולקולרית ברמת פרופילים מבניים של חומרים בתפזורת משלימים מידע על הטופוגרפיה microscale וחספוס של פני השטח cuticular. כדי להעריך את היכולות cross-linking של cuticles dewaxed של wild-type ו יחיד הגן פירות מעובדים עגבניות מוטציה, MAS 13 C NMR נעשה שימוש כדי להשוות את הפרופורציות היחסיות של aliphatic מחומצן (CHO ו-CH 2 O) moieties כימיים.

Dewaxing ממצה על ידי מיצוי Soxhlet בשלבים עם פאנל של ממיסים של הקוטביות משתנה מספק אמצעי יעיל לבודד moieties שעווה על בסיס המאפיינים הידרופובי של aliphatic שלהם ומרכיבים ארומטיים, תוך שמירה על המבנה הכימי של biopolyester cutin. מיצוי מכני של שעוות epicuticular ו Seleהסרת ctive של שעוות intracuticular, כאשר בפיקוח על ידי שיטות פיזיות משלימים, מספק אמצעים חסרי תקדים כדי לחקור את מכלול לציפורן: גישה זו חושפת את הארגון סופראמולקולרית אינטגרציה מבנית של סוגים שונים של שעווה, הארכיטקטורה של מטריקס cutin שעווה, וכן חומר כימי ההרכב של כל מרכיב. בנוסף, מצב מוצק 13 C NMR מגלה הבדלים במספרים היחסיים של CHO ו-CH 2 moieties הו כימיים עבור פירות אדומים wild-type ו מוטציה עגבניות בשלות. את שיטות תמ"ג מציעים כלים יוצאי דופן כדי טביעות אצבע המבנה המולקולרי של חומרים cuticular כי הם לא מסיסים, אמורפי, ו הטרוגנית מבחינה כימית. כטכניקה קרקע סלקטיבית לא פולשנית הדמיה, AFM מספק אמצעי יעיל וישיר לחקור את הארגון המבני של האסיפה cuticular בהיקף ננומטר-מיקרומטר אורך.

Protocol

1. בידוד האנזימטית של עגבניות cuticles 5 מניחים עגבניות מסחריים או מעובדת כמה בקערה. מקלפים את העור מפירות בחלקים ניכרים, לבטל את רקמת המעטפת הפנימית. שוטפים את קליפות העגבניות במים deionized ולשמר אותם תחת מים בכוס. הכן 50 מ"מ 4.0 pH נתרן אצטט חיץ (ב 31 ° C) על ידי הצבת 1.22 גר 'נתרן אצטט trihydrate (M r. 136.08 g / mol) ו – 2.34 גרם חומצה אצטית קרחונית (17.485 M) בכוס, להוסיף 200 מ"ל מים deionized ולאחר מכן להתאים את pH עד 4.0 על 31 ° C. להכין תערובת המכילה 4 מ"ל של pectinase (EC 3.2.1.15, 10 U מ"ל -1, TCI אמריקה), 0.2 גרם של cellulase (EC 232.734.4, 1.3 יחידות / מ"ג מוצק, Sigma Aldrich), ו 13 מ"ג NaN 3, ולאחר מכן להוסיף 196 מ"ל של נתרן אצטט חיץ לתערובת אנזים להשיג 200 מ"ל של קוקטייל האנזים האחרון. 5 לחלוטין לטבול את העור עגבניות קלופות ב קוקטייל האנזים דגירהב 31 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עם הרעידות קבוע (G24 הסביבה החממה שאכר, ניו ברונסוויק מדעי ושות). לאסוף את קליפות העגבניות בעזרת מסננת מטבח או משפך בוכנר ולשטוף אותם במים deionized. לאחר מכן, למקם אותם בתנור ואקום בטמפרטורת החדר במשך שעה. לשמור על העור עגבניות מיובשות בבקבוק שכותרתו כתרים על נהלים dewaxing הבאים. 2. Dewaxing ממצה על ידי הפקת Soxhlet 6 ציוד המשמש dewaxing ממצה מורכב מקור חום (חימום המעטפת ואת Variac בקר), צפחת התחתונה עגול מאגר ממס, Soxhlet חולץ, sintered זכוכית אצבעון אצבעון או מיצוי חד פעמיות, נגד הקפצת צ'יפס הקבל (ראה איור. 1). ראוי לציין, כי הזרוע סיפון צר (חלקים 6 ו 7 באיור. 1) הוא עדין מאוד ונוטים שבירה, הדורש טיפול זהיר. שים 0.5-1 גרם של העור עגבניות (שהושגושלב 1.) במכתש, וטוחנים לאבקה מדגם גס עם העלי אלא אם הדגימות ישמשו למדידות AFM (סעיף 5). למלא אצבעון sintered זכוכית או חד פעמי של כ באמצע הדרך עם המדגם להשתמש בפינצטה כדי למקם אותה בזהירות בבסיס הטור החילוץ. חבר את הקבל ולעטוף אותו בנייר אלומיניום. מחממים את מתנול ממס (ACS כיתה) בנוכחות כמה אנטי הקפצת שבבי מעט עד לרתיחה בעדינות refluxes על קירות הבקבוק. מכסים את המאגר ממס עם צמר הן זכוכית נייר אלומיניום. בדוק את התהליך במשך שעה, התאמת מתח Variac כך המאגר מצטבר על טיפה אחת לשנייה המים והעברתם מתרחשת בתוך המנגנון Soxhlet כאשר אצבעון מלא. להמשיך את תהליך החילוץ של 12 שעות, ואז להוריד את המעטפת חימום לאפשר מנגנון להתקרר. הסר את Extractor ו המאגר כיחידה אחת כדי להיפטר ממס. השתמש למרוטRS להעלות את אצבעון ממש מתחת לצוואר הטור חילוץ, לניקוז עודפי הממס ממנו, להציב את האצבעון על משטח נקי. להטות את הטור החילוץ לאפשר יניקה לתוך הבקבוק למטה. נתק את הבקבוק ולשפוך את הפסולת לתוך כלי קיבול בזבוז שכותרתו ממס. חזור על שלבים 2.3 ו 2.4 עבור ממיסים רצופים של הקוטביות בהדרגה הולכת ופוחתת, כגון כלורופורם ו הקסאן עבור H 12 בכל מקרה ומקרה. אפשר מדגם cutin עגבניות להתייבש בתוך אצבעון, או על ידי פיצוץ זרם של גז חנקן על זה או על ידי הצבת אותה בתנור ואקום בטמפרטורת החדר. לבסוף, למדוד את המסה של מדגם יבש לשמור אותו בטמפרטורת החדר בצנצנת פקק הברגה חתום parafilm. 3. בידוד סלקטיבי של שעוות Epicuticular ו Intracuticular 3,4 ראשית, לשטוף את עגבניות שלמות (סדרה נפרדת של עגבניות מאלה המתוארים 1.) עם מים מזוקקים. לייבש אותם עם פאפמגבות מיון, Kimwipes, ומניחים אותם כלפי מטה נובע על פיסת נייר אלומיניום. לצייר את העגבניות שלמות עם 120% (w / w, יחס מסה) פתרון ערבית מסטיק מימית בראש מטה אופנה לאפשר כשעה על מסטיק ערבית להתייבש על העור של פירות, משאיר שכבה דקה. הסר את הסרט באמצעות פינצטה, נזהרים שלא לנקב את העור עגבניות. לחזור על התהליך פעם נוספת. הוסף את הסרטים כדי בקבוקונים המכילים 1:1 (V / V) כלורופורם מים ומערבבים במשך שלוש דקות. לאחר תסיסה נמרץ הפרדת פאזות, פיפטה את השברים כלורופורם להתאדות אותם בקבוקונים שנחשפו נפרדים, משאיר שעווה epicuticular. העגבניות יישאר ללא שינוי פיזי. טובלים אותם כלורופורם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את השעווה intracuticular לאחר אידוי הממס. עכשיו, קליפת העגבניות ולהתייחס אליהם enzymatically (עם cellulase ו pectinase במאגר נתרן אצטט) להסיר תאית פקטין, בהתאמה (כמתואר <strאונג> 1). אם תרצה, לבצע dewaxing ממצה על אלה cuticles מבודדים enzymatically ידי מיצוי Soxhlet (ראה שלב 2), באמצעות שלושה ממסים של הקוטביות משתנה (מתאנול, כלורופורם, ואת הקסאן, בהתאמה). 4. אפיון מולקולארי של cutin פירות עגבניות ידי קיטוב-קרוס קסם זווית תהודה ספינינג מצב מוצק מגנטית גרעינית (CPMAS ssNMR) 6 מקום 4-6 מ"ג cuticles עגבניות dewaxed מלא (cutins) ב 1.6 מ"מ fastMAS zirconia הרוטור באמצעות המסופקים על כלי אריזה. (או dewaxed הקרקע עגבניות cuticles או חתיכות קטנות מאוד של cuticles dewaxed חלקית מתאימים.) ודא כי המדגם הוא ארוז בצורה אחידה, אך לא חזק מדי, על הרוטור. לאחר הנחת המכסה העליון, לצייר את מחצית שווי בעט שחור דיו הסמן כדי להקל על מדידות של שיעור ספין. התאם shimming של ספקטרומטר התמ"ג עבור רוחב הקו המינימלי רפאים בגובה מחציתND לכייל פרוטון (1 H) ופחמן (13 C) 90 ° מעלות רוחב הדופק באמצעות תרכובת סטנדרטיים כגון adamantane. שימוש או גליצין גלוטמין כמו תרכובות מודל, להשיג עוצמת האות המרבי על ידי אופטימיזציה של כל הפרמטרים (הרטמן, האן רמות הספק תואמים, 1 H-13 C זמן מגע, כוח heteronuclear 1 H decoupling) של קיטוב בין קסם זווית ספינינג (CPMAS) הניסוי. עבור ספקטרום רכשה בתדר H 1 של 600 MHz, תנאי המומלצות 10 kHz או 15 kHz תדירות ספינינג, עיכוב של 3 שניות בין רכישות, פרוטון heteronuclear השדרה decoupling 7 על כוח שדה מגנטי שווה בתדירות של kHz 185. הכנס את הרוטור cutin וגדוש לתוך החללית. לאחר מכן, למקם את החללית אל מגנט. להגדיל את המהירות ספינינג עד kHz 10 בהדרגה כדי לבדוק אם האריזה מדגם טוב יציבות הרוטור. בדוק את יציבות ספינינג הסופי של הרוטור עד למרחק של± 20 הרץ. התאם את כוונון והתאמה קבלים של בדיקה חוזרת על מנת להשיג השתקפות הכוח המינימלי בשני H 1 ו -13 ג תדרים תמ"ג. קבע את טמפרטורת הניסוי עד 25 ° C (או בטמפרטורת החדר). להתחיל מראש אופטימיזציה CPMAS הניסוי המתאים למצב הרטמן, האן התאמת נקבע בתדר 10 קילוהרץ ספינינג. לרכוש 4096 ארעיים, המצב ספקטרום עם קו מעריכי (הלורנצי) הרחבה של 50-100 הרץ, ולעשות פורייה להפוך ליצור ספקטרום NMR של עוצמת האות הכימי לעומת מיגון (ppm). הפניה כימי 13 C משמרות חיצוני באמצעות מערכת adamantane עמודים לדקה 38.4 (CH-2 – הקבוצה) 8 כסטנדרט. להגדיל את תדירות מסתובב הרוטור כדי kHz 15 וחזור על המדידה CPMAS (צעדים 4.6-4.8) המתאים למצב הרטמן, האן התאמת נקבע בתדר זה ספינינג האחרון. Repeבכל הניסויים CPMAS (צעדים 4.1-4.9) עם דגימות לציפורן הטבעית (שעווה) ו dewaxed חלקי הפרי. 5. חיטוט לציפורן עגבניות שטח עם מיקרוסקופית כוח אטומי (Digital מכשירים Nanoscope IIIa, נהלים ישתנו מעט בין מיקרוסקופים) 6 הפעל את המיקרוסקופ בדיקה סריקה (SPM) (איור 2) ולוודא כי מצב מיקרוסקופ מתג מצבי מוגדר מיקרוסקופית כוח אטומי קשר (AFM) מצב. באופן ידני להעלות את הראש SPM על ידי סיבוב שני שלה למשתמש ידיות מתכווננות הקדמיות. ניתוק tipholder AFM מהראש SPM על ידי סיבוב בורג לחיצה בחלק האחורי של הראש. להשתמש בפינצטה כדי להסיר את הקיים שלוחה AFM מ tipholder, אז בזהירות לתפוס סיליקון ניטריד שלוחה חדשה (AFM בדיקה) מהאריזה ולהתקין אותה במקום שלוחה הישן. במיקרוסקופ אור כדי לוודא שלוחה שהותקנה AFM לא נשבר. צרף הלציפורן דואר מדגם עגבניות (קטע לציפורן עגבניות dewaxed חלקית ~~~HEAD=NNS 10 מ"מ X 10 מ"מ) לדיסק נירוסטה (מדגם דיסקוס) עם סרט דו צדדית. במיקרוסקופ אור כדי לוודא את פני השטח לציפורן נשאר שטוח וחלק אחרי המיקום של המדגם על דיסקית. מניחים את דיסקית עם מדגם עגבניות לציפורן על האזור המגנטי בחלק העליון של הסורק SPM. הגדר את החזית שני ברגים התאמה ידנית של הסורק גבוהה על ידי סיבוב הכפתורים, לקבוע תקנון ממונע הבורג בחזרה לרמה של כ זהה את שני הברגים האחרים הקדמיות. לוודא כי כל שלושת הברגים נקבעים גבוה מספיק כדי למנוע שבירת קצה AFM בעת ביצוע tipholder בראש SPM. והכנס tipholder בראש SPM ולאבטח אותו על ידי הידוק בורג לחיצה בחלק האחורי של הראש. לאחר הפעלת לייזר, ליישר את המקום לייזר על שלוחה AFM באמצעות מרכזי (Y) הנכונים (x) התאמת ידיות לייזר על החלק העליון של הראש.לפקח על קרן לייזר לידי ביטוי על פיסת נייר כדי למקם את נקודת לייזר בדיוק בסוף שלוחה AFM. להתאים את המיקום של המראה מטלטלין חוזרת באמצעות כפתורים התאמה photodetector להשיג אות לכל היותר (האות SUM), ובכך להבטיח כי קרן לייזר לידי ביטוי מתקבלת באופן שווה על ידי ארבעת הרביעים של photodetector. מנמיכים את קצה AFM ידי retracting הקדמיות את הברגים ידנית התאמה והסתגלות ממונע חזרה הבורג של הסורק SPM, מעקב חזותי את הגישה של קצה AFM כלפי מדגם השטח עם מיקרוסקופ הפוכה. לוודא כי כל שלושת הברגים הם באותה רמה, כדי למנוע artifacts מ הדמיה מדגם מוטה. להביא עצה לקראת המדגם, אך לא כל כך קרוב שקצה נגיעות או שברים באמצעות מדגם השטח. בנקודה זו, אור הלייזר המוחזר מן שלוחה AFM יהיה להקפיץ את המראה מטלטלין כדי photodetector. עבור מצב AFM קשר עם siliקון ניטריד AFM הטיפ, להגדיר את אות פלט (הטיה אנכית) מתח V -2 על 0 V Setpoint ואת אותות גרסאות (אנכי / אופקי ההבדל) ל -0 V על ידי התאמת המיקום של המראה. באמצעות התוכנה Nanoscope, לחצו על סמל מיקרוסקופ ובחר את הפרופיל המתאים (קשר למצב AFM). באמצעות "בקרת סריקה הגדרות" לוח, הגדר את קצב סריקה וגודל כגון סריקה, 10 מיקרון גודל סריקה 2 שיעור הרץ סריקה. אפשר עצה AFM לעסוק השטח מדגם ידי לחיצה על סמל לעסוק-עצה. על ידי שליטה על הבורג בחזרה ממונע בסיס SPM, התוכנית כרגע להוריד את הקצה עד שהוא עוסק פני המדגם. תהליך הסריקה יתחיל אוטומטית פעם עצה עוסקת בהצלחה. לפקח על תהליך הסריקה בשתי התמונות ואת היקף המצבים של התוכנה, התאמת פרמטרים כגון setpoint, רווח נפרד, רווח יחסי, גודל סריקה, קצב סריקה, קווים ודוגמאות / קו חוזרת כדי להשיג את הגבוה ביותרתמונות ברזולוציה. התחל סריקה עם מגוון Z-ציר גדול (בקנה מידה נתונים), ואז בזהירות להפחית את ערך נתונים בקנה מידה להתבונן בניגוד הטוב ביותר של תכונות פני השטח על התמונה. למזער את המופע של אזורים לבנים בתמונה סרוקה, אשר מצביעים על כך גובה את תכונות פני השטח עולה על טווח זמין Z-ציר. לכידת תמונה כדי לשמור את קובץ הנתונים, ואז לעבד את הנתונים באמצעות פונקציות משתטחים להסיר חפצים תמונה בשל סחף (Z) אנכי סורק, קשתות התמונה, ואנכי קיזוז בין שורות סריקה: 9 סוף סוף לחשב את החספוס הממוצע. לאחר שמירת נתונים, לחזור בו עצה AFM ידי היפוך פעולת המנוע מבוקרת מחשב בורג ששימש לעסוק בו. עיבוד התמונה ניתן לבצע ניתוח במצב לא מקוון תמונה ו / או שימוש במחשב אחר. השתמש הקדמיות התחתונות אפור מתכת ידיות של בעל עצה כדי לשנות את x ו-y עמדות באזור סריקה, ולאחר מכן לחזור על המדידה בחמש מדגם locations לבדוק שחזור, החלפת שלוחה AFM אם איכות התמונה מידרדר. 6. נציג תוצאות שינוי כימי ניתוח של 13 CPMAS C NMR ספקטרה (איור 3) זיהו את קבוצות פונקציונליות העיקריים הנמצאים לציפורן עגבניות dewaxed ממצה (cutin). Moieties את הפחמן מפתח biopolyester cutin נמצאו ארוכות שרשרת aliphatics (0-45 עמודים לדקה), aliphatics מחומצן (45-110 עמודים לדקה), להכפיל-ערובה ארומטיים (110-160 ppm), וכן carbonyls (160-220 עמודים לדקה). את moieties אלקיל מחומצן (CHO + CH 2 O) לשחק תפקיד מכריע ביצירת קשרים קוולנטיים בין היחידות monomeric של biopolymer cutin, ובכך יוצרים את הארכיטקטורה המולקולרית של מטריקס cutin. הבדלים בתחומים השיא יחסית שנצפו באזור רפאים בין 45 עמודים לדקה ו 100 מציעים cutin מוטציה יש שיעור גבוה יחסית של בין הקישור להרכיב CHO structura moieties השוויתי ל wild-type cutin, מדידות כמותיות מדויקות באמצעות קיטוב ישירה (DPMAS) NMR 5 שיטות לתמוך מסקנה (מידע לא מוצג). CPMAS 13 C ספקטרום NMR הראה גם שיא שעווה בהדרגה הולכת ופוחתת עמודים לדקה 31 (איור 4), המעיד על הסרת רציפה של עלית ושעוות intracuticular מ מרוכבים cutin שעווה תוך שמירה על ארכיטקטורת הכימי העיקרי של biopolymer cutin. במקביל ניתוח תמונת AFM (איור 5) גילה אי סדרים פני השטח בשל מיצוי הדרגתי של עלית ושעוות intracuticular מ לציפורן פירות, המסמל שינויים בארגון העצרת cuticular. . איור 1 Soxhlet Extractor (מקור התמונה: ויקיפדיה). "/> איור 2.) בדיקה במיקרוסקופ סריקה. ב ') ראש SPM (עיבוד ידני אימון AFM מסופק על ידי מכשירים דיגיטליות). איור 3. 150 MHz CPMAS 13 C ספקטרום NMR של dewaxed ממצה אדומים בשלים פירות cuticles עגבניות (cutins) של wild-type (M82) ו מוטציה (CM15) הצג תהודות עם חומר כימי עובר המתאים על קבוצות פונקציונליות של חומצה צולבים hydroxyfatty מבוסס פוליאסטר וגם כמה moieties מלוכדות מתרבים. ספקטרום כל נרכשו בתדירות 10 kHz ספינינג. איור 4. 150 MHz 13 CCPMAS ספקטרום NMR של מסחר cuticles אדומים פרי בשל עגבניות להציג שינויים ההלחנה עם הסרת רציפה של שעוות epicuticular ו intracuticular ידי מיצוי מסטיק ערבית מכני TWo דקות טבילה כלורופורם, בהתאמה. ספקטרום כל נרכשו בתדירות 15 kHz ספינינג. באיור 5. תמונות AFM ואומדנים החספוס של עגבניות מסחרי dewaxed חלקית cuticles המתואר באיור 4 לאחר הסרת בשלבים של (מימין) שעוות epicuticular (משמאל) intracuticular.

Discussion

פרוטוקולים שתוארו לעיל מאפשרים אפיון מולקולרית microscale מפורטת של חומר צמחי מורכבת סורר ללא צורך פירוק כימי הרסני. כדי לחקור את השילוב של biopolyester cutin עם שומנים שונים (שעווה) השולטים הארגון המבני של האסיפה cuticular, 10 קיימנו פיקוח הליכים להסרת סלקטיבית של שעוות epicuticular ו intracuticular מתערובת cuticular הטרוגנית. מצב מוצק 13 C NMR נעשה שימוש כדי לאמוד החילוץ של רכיבים מולקולריים שעווה, וכן במיקרוסקופ כוח אטומי שימש לבחון שינויים מקבילה חספוס פני השטח. 6,11 להשוות את cross-linking היכולות של cutins מן הגן, אחת מעובדות wild-type ו פירות עגבנייה מוטנטים, מצב מוצק 13 C NMR שימש גם כדי להעריך את היחס בין CHO ו-CH 2 O moieties כימיים.

מספר תכונת עיצובים של פרוטוקול זה בולטים. כמו חומרי שעווה תקיף מגוון רחב של שומנים, טיפול לציפורן פירות עם סדרה של ממסים שיש קטבים מסתעף הוא חיוני על מנת להשיג dewaxing ממצה. בנוסף, זמן dewaxing יכול לנוע בין 8 שעות ל -24 שעות בהתאם לאופי של דגימות לציפורן. כדי לחלץ שעוות epicuticular בעקביות לציפורן פירות שלמים, חובה ליישם ציפוי דבק באופן אחיד על פני השטח.

מצב מוצק CPMAS 13 C NMR 12 היא שיטה מהירה איכותית לזיהוי רכיבים מבניים שונים של צמחים biopolymers הטרוגנית מאוד מסיס תוך שמירה על המאפיינים הפיזיים מוצאם; 13 NMR המסורתית פתרון של מדינה יכול לשמש גם כדי לאפיין את תערובות שעווה שחולצו. אם הערכה כמותית של קבוצות פונקציונליות הרצוי עבור פולימרים צמחיים שלמים, 5 באיכות גבוהה קיטוב ישיר קסם זווית ספינינג (ד 'PMAS) 13 C NMR 5,14 צריך לשמש כאמצעי משלים. Quantitation מדויק של קבוצות פונקציונליות דורש אופטימיזציה זהירה של פעמים למחזר, דופק אורכי עירור ואת העוצמה של decoupling heteronuclear. 15 decoupling heteronuclear ניתן להגדיר כוח H 1 בתחום החל kHz 50 עד 185 kHz באמצעות 16 או TPPM עמוד השדרה 7 מתודולוגיות. בנוסף פרמטרים אלה, את הרגישות של המדידות CPMAS תלוי זמן ספין המנעול הרטמן, האן במצב תואם. 15 במקום CPMAS מסורתיים, ramped-משרעת CP (Ramp-CP) הטכניקה ניתן ליישם על מנת למקסם את הצלב הקיטוב, יעילות על ידי שינוי האמפליטודה 1 H באופן ליניארי (~ 20-50%) או בנקודת השקה תוך שמירה על משרעת של כוח C 13 בשדה קבוע בתקופה ספין המנעול (או להיפך). 17,18 בביצוע מדידות CPMAS ב מינימום של RO 2 שונהTor-ספינינג תדרים חובה להבחין sidebands ספינינג מן פסגות רפאים העיקריים.

במקביל מדידות שנערכו AFM במצב מגע לאפשר הדמיה ישירה של מצב פני השטח לציפורן עם מהירויות סריקה גבוהות ברזולוציה גבוהה, 19 למשל במהלך הסרת רציפה של המרכיבים דונגי. הפעלה ב AFM הקשה (ללא מגע) במצב ניתן להשתמש כתחליף לאפיון פני השטח של חומרים עדינים "רכים" צמחים, נמנע נזק אפשרי בשל (גזירה) כוחות בצירי גירוד של מדגם השטח. 5,20 בכל מקרה , רכישה רציפה של מספר רב של תמונות של נקודה על פני השטח משמש לזיהוי נזק לפני השטח בשל "החללית על פני קרום אינטראקציות" במדידות AFM. 6,21 עבור שחזור אופטימאלי, בדיקות AFM עם קבועי קפיץ מתאים משטחים רכים cuticular צריך להיות שימוש ולאחר קביעות של טמפרטורה ולחות יש לשמור. 6,15,20 </sאת> בעוד התמ"ג של מצב מוצק מציע הפרופיל המולקולרי של ההרכב הממוצע (בתפזורת) נכסים cuticles פירות עגבניות, הדמיה כוח אטומי מספק בדיקה פולשנית משלימה 22,23 למעקב אחר הטופוגרפיה משטח של מכלולים אלה macromolecular מורכבים להפליא. 1,2

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של ארה"ב מענקים # MCB-0741914 ו MCB-0843627, תמיכה תשתית נוספת נמסר במכללת ניו יורק על ידי המכונים הלאומיים לבריאות 2 RR03060 G12-26 של המרכז הלאומי למשאבי מחקר. אנו בתודה להכיר JKC רוז קבוצת במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קורנל הצמח למתן M82 (סוג בר) ו CM15 (מוטציה) cuticles עגבניות. אנו מודים לד"ר Spyros Monastiriotis מקבוצת הנדסה כימית CCNY של פרופ 'אלכסנדר Couzis לעזרה נדיבה עם הניסויים AFM. אנו מודים לגב 'לורן Gohara לתמיכה עיצוב גרפי.

Materials

Name of the reagent Company Catalog no. Comments
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S8625-500G  
Pectinase TCI America P0026 EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator
Cellulase Sigma-Aldrich C1184-100KU EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator
Glacial Acetic acid Sigma-Aldrich A9967  
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G Extremely hazardous
Incubator/shaker New Brunswick Scientific Co. Model No.G24 MFG No.M1036-000G
Vacuum Oven Precision Scientific 31566  
Variac Controller      
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) VWR 89056  
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) VWR 28320  
Methanol VWR EMD-MX0485-7  
Glass wool VWR RK20789  
Aluminum foil Fisher 01-213-100  
Tweezers VWR 82027-452  
Chloroform VWR EM-CX1050-1  
Hexane Fisher Scientific H302-4  
Nitrogen gas      
Parafilm VWR 52858  
Paper towels VWR 89002-984  
Kim wipes VWR 21905-026  
Gum arabic Sigma G9752  
1.6 mm fastMAS zirconia rotor Varian (Agilent)    
NMR spectrometer Varian 600 NMRS standard bore magnet  
Glycine Sigma-Aldrich 50046 Model compound for CPMAS
Glutamine Sigma-Aldrich 49419 Model compound for CPMAS
Adamantane Sigma-Aldrich 100277 To calibrate 90° pulse in NMR
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) Digital Instruments (Bruker AXS)    
Nanoscope software Digital Instruments (Bruker AXS)   Version 5.30r3sr3 (2005)
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) Veeco (Bruker AXS) Model NP-20  
Light microscope Digital Instruments    
Magnetic puck Digital Instruments    
Double sided tape VWR    
Fruit Peeler      
Büchner funnel VWR 89038  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. The biophysical design of plant cuticles: an overview. New Phytologist. 189, 938-949 (2011).
  2. Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes – a smart material?. Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).
  3. Jetter, R., Schäffer, S. Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development. Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).
  4. Vogg, G. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid β-ketoacyl-CoA synthase. J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).
  5. Isaacson, T. Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss. Plant J. 60, 363-377 (2009).
  6. Round, A. N. The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR. Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).
  7. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids. J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).
  8. Morcombe, C. R., Zilm, K. W. Chemical shift referencing in MAS solid state NMR. J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).
  9. Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods. J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).
  10. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).
  11. Stark, R. E. NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters. Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).
  12. Schaefer, J., Stejskal, E. O. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle. J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).
  13. Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions. Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).
  14. Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester. Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).
  15. Stark, R. E., Garbow, J. R. Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall. Macromolecules. 25, 149-154 (1992).
  16. Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids. J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).
  17. Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR. J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).
  18. Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization – Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields. J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).
  19. lessandrini, A., Facci, P. AFM: a versatile tool in biophysics. Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).
  20. Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques. J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).
  21. Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM). J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).
  22. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemie. 47, 7986-7998 (2008).
  23. Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).

Tags

IsolationBiophysical StudyFruit CuticlesHydrophobic Protective LayerTerrestrial PlantsDefensive BarrierBiotic StressAbiotic StressWater FlowExternal EnvironmentCutinLong-chain Fatty AcidsWaxesStructural FrameworkCuticular LayerEpicuticular LayerIntracuticular WaxesComprehensive ProtocolCommercial Tomato Fruit CuticlesSequential Wax RemovalSolid-state Cross-polarization Magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR SpectroscopyAtomic Force Microscopy (AFM)Molecular-level Structural ProfilesBulk MaterialsMicroscale TopographyRoughnessCuticular SurfacesCross-linking Capabilities

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Chatterjee, S., Sarkar, S., Oktawiec, J., Mao, Z., Niitsoo, O., Stark, R. E. Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles. J. Vis. Exp. (61), e3529, doi:10.3791/3529 (2012).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image