果実キューティクルの単離と生物物理学的研究

1。トマトキューティクル5の酵素の単離ボウルにいくつかの商用または栽培トマトを置きます。大規模なセクションの果実から皮をむき、内側の果皮組織を破棄します。脱イオン水でトマトの皮を洗浄し、ビーカーに水の下でそれらを保持します。 200 mlを加え、酢酸ナトリウム三水和物（M rを 136.08グラム/モル）とビーカーに2.34ミリリットルの氷酢酸（17.485 m）の1.22グラムを入れて、50mMのpH4.0の酢酸ナトリウム緩衝液（31℃で）を準備その後、脱イオン水、31でpHを4.0に調整℃に、、13ミリグラムのNaN 3、、セルラーゼの0.2グラム（1.3単位/ mg固体、シグマアルドリッチEC 232.734.4）ペクチナーゼ（10 U ml -1の 、TCIアメリカEC 3.2.1.15）の4ミリリットルを含有する混合物を準備します。そして、最終的な酵素カクテルの200ミリリットルを取得するために酵素混合物に酢酸ナトリウム緩衝液196 mlを加える。5完全に酵素カクテルの皮をむいたトマトの皮を浸すとインキュベート一定に振とうしながら24時間31℃（G24環境インキュベーターシェーカー、ニューブランズウィックサイエンティフィック社製）。 キッチンストレーナーまたはブフナー漏斗を用いてトマトの皮を収集し、脱イオン水で洗い流してください。その後、1時間室温で真空オーブン中に置きます。その後の脱蝋手順については、ラベルとキャップをボトルにドライトマトの皮を保存します。 2。ソックスレー抽出6で網羅的な脱ろう徹底的な脱脂に使用される装置は、熱源（加熱マントルおよびVariacのコントローラ）、溶剤貯留丸底フラスコに、ソックスレー抽出器、焼結ガラス指ぬきまたは使い捨て抽出シンブル、アンチバンプチップとコンデンサー（ 図を参照して構成されています。 1）。狭いサイフォンアーム（部品図 6と7。1）慎重な取り扱いを必要とする、非常にデリケートで破損しやすいことに注意してください。 （で得られたトマトの皮の0.5〜1 gを置くモルタルのステップ1）、およびサンプルのAFM測定結果（セクション5）のために使用される限り、乳棒を用いて粗粉末にサンプルを挽く。サンプルとほぼ中間焼結ガラスや使い捨て指ぬきを記入し、抽出塔のふもとに慎重に配置するピンセットを使用しています。 コンデンサーを取り付け、アルミホイルでラップします。フラスコの壁にそれは静かに沸騰し、還流するまで、いくつかのアンチバンプチップの存在下でメタノール溶媒（ACSグレード）を加熱する。グラスウールとアルミ箔の両方を持つ溶媒槽をカバーしています。指ぬきがいっぱいになったときにソックスレー装置内の貯水池は毎秒約一滴を蓄積できるようにVariacの電圧を調整し、サイフォン、時間のプロセスが発生し確認してください。 加熱マントルを下げ装置はクールダウンすることができますし、12時間抽出処理を続行します。溶剤を処分する単一のユニットとして抽出し、貯水池を削除します。ピンセットで抜く使用rsはちょうど抽出カラムの首下に指ぬきを高めるために、そこから溶剤を過剰に排出し、きれいな表面に指ぬきを配置します。以下のフラスコにサイフォンを許可する抽出カラムを傾けます。フラスコを外し、ラベル廃溶剤レセプタクルに廃棄物を注ぐ。 徐々に減少して極性、それぞれのケースで12時間例えば、クロロホルム、ヘキサンの連続した​​溶剤のためのステップ2.3と2.4を繰り返します。 トマトクチンサンプルはシンブル内部に、いずれかを介して窒素ガスの流れを吹き込んで、または室温で真空オーブン中に置くことによって乾燥することができます。最後に、乾燥した試料の質量を測定し、パラフィルムで密封スクリュートップ瓶に室温で保管してください。 3。 EpicuticularとIntracuticularワックス3,4の選択的分離まず、蒸留水で（1に記載したものからトマトの別のバッチ。）全体トマトを洗ってください。 PAPでそれらを乾燥させERのタオル、キムワイプ、それらをアルミ箔の部分に下向きの幹場所。 120％（w / wで、質量比）のファッション、トップダウンのアラビアガム水溶液でホールトマトをペイントし、薄膜を残し果物の皮を乾燥するアラビアガム、約1時間ことができます。ない穿刺トマトの皮をに注意しながら、ピンセットを使用して、このフィルムを取り外します。もう一度手順を繰り返します。 3分間の1:1（v / v）のクロロホルム – 水とミックスを含むバイアルにフィルムを追加します。激しく撹拌し、相分離後、クロロホルム画分をピペットとepicuticularワックスを残して、別の発見バイアルにそれらを蒸発させる。トマトは、物理的にそのまま残ります。室温で2分間クロロホルムにそれらを浸漬し、溶媒を蒸発させた後intracuticularワックスを収集します。今、トマトの皮と（で説明したように、それぞれ、セルロースとペクチンを削除するには、（酢酸ナトリウム緩衝液にセルラーゼおよびペクチナーゼを含む）酵素的にそれらを扱う<strオング> 1）。 必要に応じて、様々な極性の3溶媒（それぞれ、メタノール、クロロホルム、ヘキサン、）を使用して、（手順2を参照）ソックスレー抽出によりこれらの酵素的に孤立した甘皮に徹底的な脱脂を行います。 4。クロス偏波マジック角スピニングソリッド·ステート·核磁気共鳴法によるトマト果実のクチンの分子キャラクタリゼーション（CPMAS SSNMR）6 ベンダー提供のパッキングツールを使用して、1.6ミリメートルfastMASジルコニアローターで完全に脱蝋トマトキューティクル（cutins）の代わりに4から6ミリグラム。 （グランド脱蝋トマトキューティクルあるいは部分的に脱脂キューティクルの非常に小さな部分のいずれかが適しています。）ローターではなく、あまりにもしっかりとサンプルが均一に充填されていることを確認、しかし。上部のキャップを装着した後、スピン速度の測定を容易にするために、黒インクのマーカーペンでキャップの半分をペイントします。 半分の高さで最小のスペクトル線幅のNMR分光計のシミングを調整するndはプロトン（1 H）と炭素（13 C）90°パルス幅などのアダマンタンなどの標準的な化合物を用いたキャリブレーション。 モデル化合物としてグリシンまたはグルタミンを使用して、（ハルトマン-ハーンマッチングのパワー·レベル、1 H – 13 Cの接触時間、異種1 Hデカップリング強度）すべてのパラメータを最適化することで、最大の信号強度を取得する交差偏波マジック角スピニング（CPMAS）実験。 600 MHzの1 H周波数で取得したスペクトルについては、推奨条件は、10 kHzまたは15 kHzの回転周波数、買収、および185 kHzの周波数に相当する磁界の強さで7デカップリング脊髄異種プロトンの間に3秒の遅延が含まれています。 プローブにクチンパックローターを挿入します。その後、磁石にプローブを配置します。徐々に良いサンプルのパッキングと、ロータの安定性を確認するために、最大10 kHzまで回転速度を増加させます。以内にローターの最終的な回転安定性を確認します。±20 Hzです。 チューニングを調整し、1 Hおよび13 C NMR周波数の両方で最小電力の反射を達成するために反復的にプローブのコンデンサをマッチング。 25°C（または室温）に実験的な温度を設定します。 10 kHzの回転周波数で決定さハートマン·ハーンマッチング条件に対応する最適化済みのCPMAS実験を開始します。 指数関数（ローレンツ）ラインが50から100 Hzの拡大で4096過渡状態のスペクトルを取得し、フーリエ変換は、信号強度対化学シールド（ppm）のNMRスペクトルを生成するために変換を行う。 標準で8から13 Cの化学物質が外部から38.4 ppmの（-CH 2群）でアダマンタンセットを使用してシフトを参照。 15 kHzにローターの回転周波数を増加させ、この後者の回転周波数で決定さハートマン·ハーンマッチング条件に対応するCPMAS測定（ステップ4.6から4.8）を繰り返します。 REPECPMAS実験（ステップ4.1から4.9）で自然（モチ性）と、部分的に脱蝋果実表皮のサンプルである。 5。原子間力顕微鏡によるトマトのキューティクルの表面プローブ（デジタルインスツルメンツナノスコープIIIaを、手順は、顕微鏡の間で若干異なります）6 走査型プローブ顕微鏡（SPM）（ 図2）をオンにして、顕微鏡モードをトグルスイッチは、接触原子間力顕微鏡（AFM）モードに設定されていることを確認してください。 手動でユーザが調整可能な2つのフロントノブを回すことによりSPMヘッドを上げる。頭の後ろでクランプネジを回して、SPMヘッドからのAFM tipholderをデタッチします。 tipholderから既存のAFMカンチレバーを削除するには、ピンセットを使用し、慎重に、そのパッケージから新しい窒化ケイ素カンチレバー（AFMプローブ）を取得し、古いカンチレバーの代わりにそれをインストールします。新しくインストールされたAFMカンチレバーが壊れていないことを確認するために光学顕微鏡を使用しています。 目を添付両面テープとステンレス鋼ディスク（サンプルパック）に電子トマトキューティクルサンプル（部分的に脱蝋トマトキューティクルのセクション〜10ミリメートル×10ミリメートル）。キューティクルの表面がパックのサンプルを配置した後に平滑なままであることを確認するために光学顕微鏡を使用しています。 SPMスキャナの上部磁性領域の上にトマトの表皮サンプルでパックを配置します。 ノブを回して高スキャナの前面に2つの手動調整ねじを設定します。他の二つの前面のネジとほぼ同じレベルに電動バック調整ネジを設定します。すべての3つのネジをSPMヘッドにtipholderを配置するときにAFMチップを壊してしまわないように十分に高く設定されていることを確認してください。 SPMヘッドにtipholderを挿入し、頭の後ろでクランプネジを締めて固定します。 レーザーをオンにした後、頭の上に中央（y）と右（x）はレーザーの調整ノブを使用したAFMカンチレバー上にレーザースポットの位置を合わせます。正確にAFMカンチレバーの端にレーザスポットの位置を紙の上に反射したレーザビームを監視します。 したがって、反射されたレーザビームは光検出器の4つの象限で均等に受信されていることを確認し、繰り返しの最大信号（和信号）を達成するために光検出器の調整ノブを使用して可動ミラーの位置を調整します。 視覚的に倒立顕微鏡で試料表面に向かってAFMチップのアプローチを監視し、後退手動調整フロントのネジによってAFMチップとSPMスキャナの電動バック調整ネジを下げます。すべての3つのネジは、撮像傾いた試料からのアーチファクトを避けるために、同じレベルであることを確認してください。サンプルに向かって先端をもたらすが、そう閉じないその先端に触れたり、試料表面を突き破る。 この時点では、レーザ光は、AFMのカンチレバーは、光検出器の可動ミラーで反射され反射。 SILIとの接触AFMモードでのコン窒化AFM探針、ミラーの位置を調整することにより、0 Vから0 V設定値とDIFF信号（水平/垂直の差）のために-2 Vへの出力信号（垂直偏向）電圧を設定します。 ナノスコープソフトウェアを使用して、顕微鏡アイコンをクリックし、適切なプロファイル（コンタクトモードAFM）を選択します。 "スキャンコントロールの設定"パネルを使用して、スキャンレートとスキャンサイズ、例えば10ミクロンスキャンサイズと2 Hzのスキャンレートを設定します。 AFMの先端が従事するチップのアイコンをクリックして、試料表面に従事することができます。それは試料表面に係合するまで、SPMベースの電動背面のネジを制御することにより、プログラムは先端を下げます。先端が正常に従事した後、スキャンプロセスが自動的に開始されます。 反復して最高を達成するためにそのような設定値、積分ゲイン、比例ゲイン、スキャンサイズ、スキャン速度、ラインとサンプル/ラインなどのパラメータを調整し、ソフトウェアのイメージと範囲の両方のモードを使用して、スキャンプロセスを監視する解像度の画像。大規模なz軸の範囲（データのスケール）でスキャンを開始してから、慎重にイメージ上の表面の特徴の最高のコントラストを観察するために、データのスケール値を減らすことができます。表面の特徴の高さが可能なz軸の範囲を超えていることを示し、スキャンした画像の白領域の発生を最小限に抑えることができます。 データファイルを保存するイメージをキャプチャしてから、スキャンライン間の垂直方向のオフセット（Z）スキャナドリフト、画像の弓、縦に起因する画像アーチファクトを除去するために平坦化関数を使用してデータを処理し、9は、最終的に平均粗さを計算します。データを保存した後、それに従事するために使用されたコンピュータ制御のスクリューモータの動作を逆にすることによりAFMチップを撤回。画像処理は、オフライン画像解析モードおよび/または異なるコンピュータを使用して実行することができる。 スキャン範囲のxとyの位置を変更するには、チップホルダーの前面下部に灰色の金属製のノブを使用してから、5つのサンプルLOCAで測定を繰り返すtions画質が悪化した場合のAFMカンチレバーを交換し、再現性を確認する。 6。代表的な結果 CPMAS 13 C NMRスペクトルの化学シフトの解析（ 図3）徹底的に脱蝋トマトキューティクル（クチン）に存在する主要な官能基を同定した。クチンバイオポリエステルの主要な炭素部分は長鎖脂肪族（0から45 ppm）を、酸素脂肪族（45から110 ppm）で、多重結合して芳香族化合物（110から160 ppm）を、そしてカルボニル（160から220であることが判明したppm）を。酸素アルキル部分は、（CHO + CH 2 O）ことにより、クチンマトリックスの分子構造を形成し、クチンの生体高分子の単量体ユニット間で共有接続を確立する上で重要な役割を果たしています。 45と100 ppmの間でスペクトル領域で観察された相対ピーク面積の違いは、変異体クチンは、クロスリンクを形成するCHO structuraの比較的大きな割合を持っていることを示唆している野生型クチンに比べてlの部分、直接偏光（DPMAS）NMR 5つのメソッドを使用して慎重に定量的な測定は、（データは示さず）は、この推論をサポートしています。 CPMAS 13 C NMRスペクトルはまた、クチンバイオポリマーの主要な化学物質のアーキテクチャを維持しながら、クチンワックス複合からエピとintracuticularワックスの連続除去を示し、31 ppmである（ 図4）で徐々に減少するワックスのピークを示した。パラレルAFM像の解析（ 図5）はクチクラアセンブリの組織の変化を意味して、果実の表皮からエピとintracuticularワックスの段階抽出による表面の凹凸を明らかにした。 図1ソックスレー抽出器（画像出典：Wikipedia）。 "/> 図2。）走査型プローブ顕微鏡。 B）SPMヘッド（デジタルインスツルメンツが提供AFMトレーニングマニュアルから改作）。 図3野生型（M82）と変異体から徹底的に脱脂赤熟したトマト果実キューティクル（cutins）の150 MHzのCPMAS 13 C NMRスペクトルは（CM15）化学物質との共鳴を示し、架橋ヒドロキシ酸の官能基に対応するシフトベースのポリエステル、また、いくつかの乗算ボンディング部分。すべてのスペクトルは、10 kHzの回転周波数で取得した。 図4は、商業的な赤熟したトマト果実のキューティクルの150 MHzの13 CCPMAS NMRスペクトルは、順次アラビアゴムの機械的抽出によるepicuticularとintracuticularワックスの除去やTWに組成変化を示すO分のクロロホルムのディップは、それぞれ。すべてのスペクトルは、15 kHzの回転周波数で取得した。 図5のAFM像と部分的に脱脂商業トマトの粗さの推定値はepicuticular（左）とintracuticular（右）ワックスの段階を除去した後、図4で説明したキューティクル。