Isolamento e studio della biofisica cuticole di frutta

1. Isolamento enzimatica di pomodoro cuticole 5 Mettete i pomodori più commerciali o coltivata in una ciotola. Sbucciare la pelle dai frutti nelle sezioni di grandi dimensioni; eliminare il tessuto interno pericarpo. Lavare le bucce di pomodoro con acqua deionizzata e mantenere sotto acqua in un becher. Preparare una 50 mM pH 4,0 tampone acetato di sodio (a 31 ° C) mettendo 1,22 g di sodio acetato triidrato (M r. 136,08 g / mol) e 2,34 ml di acido acetico glaciale (17,485 M) in un becher, aggiungendo 200 ml di acqua deionizzata, e quindi regolando il pH di 4,0 a 31 ° C. Preparare una miscela contenente 4 ml di pectinasi (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g di cellulasi (CE 232.734.4; 1,3 unità / mg di solido, Sigma Aldrich), 13 mg e NaN 3, e quindi aggiungere 196 ml di tampone sodio acetato alla miscela di enzima per ottenere 200 ml di cocktail enzimatico finale. 5 immergere completamente la pelle pelati in cocktail enzima e incubarea 31 ° C per 24 ore con agitazione costante (G24 ambientale agitatore incubatore; New Brunswick Scientific Co.). Raccogliere le bucce di pomodoro con un colino da cucina o imbuto Büchner e lavarli con acqua deionizzata. Successivamente, metterli in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente per un'ora. Mantieni le bucce di pomodoro secchi in una bottiglia etichettata e limitato per le procedure di deceratura successive. 2. Deceratura esaustivo per estrazione Soxhlet 6 L'attrezzatura utilizzata per la deceratura esaustivo consiste in una sorgente di calore (riscaldamento mantello e Variac controller), pallone a fondo tondo per un serbatoio del solvente, Soxhlet, vetro sinterizzato ditale o ditale monouso, anti-ebollizione chip e un condensatore (vedi fig. 1). Si noti che il braccio sifone stretta (parti 6 e 7 in Fig. 1) è molto delicato e soggetto a rottura, richiedono un accurato trattamento. Mettere 0,5-1 g di pelle di pomodoro (ottenuto infase 1.) in un mortaio, e macinare il campione di una polvere grossolana con un pestello meno che i campioni devono essere utilizzato per misurazioni AFM (punto 5). Riempire un ditale vetro sinterizzato o monouso approssimativamente a metà con il campione e utilizzare una pinzetta per posizionare accuratamente alla base della colonna di estrazione. Collegare il condensatore e avvolgerlo con un foglio di alluminio. Riscaldare il metanolo solvente (ACS grado) in presenza di qualche anti-ebollizione chip fino ad ebollizione dolcemente e riflussi sulle pareti del pallone. Coprire il serbatoio del solvente sia con lana di vetro e foglio di alluminio. Controllare il processo per un'ora, regolando la tensione Variac in modo che il serbatoio si accumula su una goccia al secondo sifone e si verifica all'interno di Soxhlet quando il tamburo è pieno. Continuare il processo di estrazione per 12 h, quindi abbassare il mantello di riscaldamento e consentire l'apparecchio si raffreddi. Rimuovere l'estrattore e il serbatoio come una singola unità di disporre del solvente. Utilizzare tweezers per sollevare il ditale a appena sotto il collo della colonna di estrazione, drenare l'eccesso di solvente da esso, e posizionare il tamburo su una superficie pulita. Inclinare la colonna di estrazione per consentire sifone nel pallone sottostante. Togliere il pallone e versare i rifiuti in un contenitore per rifiuti debitamente etichettato solvente. Ripetere le fasi 2.3 e 2.4 per le successive solventi di polarità progressivamente decrescente, ad esempio, cloroformio ed esano per 12 h in ciascun caso. Lasciare il campione cutina pomodoro per asciugare all'interno del ditale, o soffiando un flusso di gas azoto sopra o ponendolo in un forno sotto vuoto a temperatura ambiente. Infine, misurare la massa del campione secco e conservare a temperatura ambiente in un tappo a vite vaso sigillato con parafilm. 3. Isolamento selettivo delle Cere Epicuticular e intracuticolare 3,4 In primo luogo, lavare i pomodori interi (un lotto separato di pomodori da quelli descritti al punto 1.) Con acqua distillata. Asciugare con paper asciugamani e Kimwipes, e metterli staminali verso il basso su un pezzo di foglio di alluminio. Dipingi i pomodori interi con il 120% (w / w, rapporto di massa), la gomma arabica soluzione acquosa in un top-down e consentire di moda circa un'ora per la gomma arabica ad asciugare sulla pelle del frutto, lasciando una sottile pellicola. Rimuovere la pellicola con una pinzetta, facendo attenzione a non forare la pelle di pomodoro. Ripetere la procedura una seconda volta. Aggiungere i film di fiale contenenti 1:1 (v / v) cloroformio-acqua e agitare per tre minuti. Dopo agitazione vigorosa e separazione di fase, pipettare le frazioni di cloroformio e far evaporare in distinte fiale scoperti, lasciando cera epicuticular. I pomodori rimarranno fisicamente integra. Passarle in cloroformio per due minuti a temperatura ambiente e raccogliere la cera intracuticolare dopo evaporazione del solvente. Ora, buccia i pomodori e trattarli enzimaticamente (con cellulasi e pectinasi in tampone sodio acetato) per rimuovere cellulosa e pectina, rispettivamente (come descritto nella <strong> 1). Se desiderato, eseguire deceratura esaustiva di tali cuticole enzimaticamente isolate mediante estrazione Soxhlet (vedi punto 2), utilizzando tre solventi di polarità diversa (metanolo, cloroformio, esano e, rispettivamente). 4. Caratterizzazione molecolare di cutina Tomato Fruit dal Cross-polarizzazione Magic-angolo di Spinning a stato solido Risonanza Magnetica Nucleare (CPMAS ssNMR) 6 Luogo 4-6 mg di cuticole pomodoro pienamente deparaffinati (cutins) in un mm 1.6 fastMAS zirconia rotore utilizzando il tool fornito dal produttore di imballaggio. (Sia le cuticole pomodoro terra deparaffinati o pezzi molto piccoli di cuticole parzialmente deparaffinati sono adatti.) Accertarsi che il campione è imballato in modo uniforme, ma non troppo stretto, nel rotore. Dopo aver messo sul tappo superiore, dipingere mezzo del tappo con un inchiostro nero pennarello per facilitare le misure della velocità di rotazione. Regolare la shimming dello spettrometro NMR per la larghezza minima riga spettrale a metà altezza unond calibrare il protone (1 H) e carbonio (13 C) 90 ° larghezza di impulso con un composto standard come adamantano. Utilizzo di glicina o glutammina come composti modello, ottenere massima intensità del segnale ottimizzando tutti i parametri (Hartmann-Hahn corrispondenti livelli di potenza, 1 H – 13 C tempo di contatto, eteronucleari 1 H resistenza disaccoppiamento) delle cross-polarizzazione magic-angle spinning (CPMAS) esperimento. Per spettri acquisito a una frequenza di 1 H 600 MHz, condizioni raccomandate comprendono 10 kHz o 15 kHz frequenza di filatura, una 3-sec ritardo tra acquisizioni, e spinale protone eteronucleari disaccoppiamento 7 ad una intensità di campo magnetico equivalente a una frequenza di 185 kHz. Inserire il cutina ricco di rotore nella sonda. Quindi, posizionare la sonda nel magnete. Aumentare la velocità di rotazione fino a 10 kHz a poco a poco per verificare imballaggio buon esempio e la stabilità del rotore. Verificare la stabilità di filatura finale del rotore entro± 20 Hz. Regolare la sintonizzazione e corrispondenti condensatori della sonda iterativo per ottenere la riflessione minimo di energia sia 1 H e 13 C NMR frequenze. Impostare la temperatura sperimentale a 25 ° C (o temperatura ambiente). Avviare il pre-ottimizzato esperimento CPMAS corrispondente alla Hartmann-Hahn determinata condizione di corrispondenza con la frequenza 10 kHz filatura. Acquisire 4096 transitori, condizione dello spettro con esponenziale (Lorentzian) linea ampliamento di 50-100 Hz, e fare una trasformata di Fourier per generare uno spettro NMR di intensità del segnale vs chimica schermatura (ppm). Fare riferimento alla chimica C 13 turni esternamente usando set adamantano a 38,4 ppm (-CH 2 – gruppo) 8 come standard. Aumentare la frequenza del rotore di filatura a 15 kHz e ripetere la misurazione CPMAS (passi 4.6-4.8) corrispondente alla Hartmann-Hahn condizione di corrispondenza determinata in questa frequenza quest'ultimo filatura. REPEagli esperimenti CPMAS (passi 4.1-4.9) con i campioni di frutta naturali (ceroso) e parzialmente decerati cuticola. 5. Sondaggio della superficie della cuticola di pomodoro con microscopia a forza atomica (Digital Instruments Nanoscope IIIa, le procedure possono variare leggermente tra i microscopi) 6 Accendere il microscopio a scansione di sonda (SPM) (Fig. 2) e assicurarsi che il selettore di modalità microscopio toggle è impostata la microscopia a forza atomica contatto (AFM) mode. Manualmente sollevare la testa SPM ruotando i suoi due regolabili dall'utente manopole frontali. Staccare il tipholder AFM dalla testa SPM ruotando la vite di bloccaggio nella parte posteriore della testa. Utilizzare delle pinzette per rimuovere il cantilever AFM esistente dal tipholder, poi accuratamente afferrare un nuovo sbalzo di nitruro di silicio (AFM sonda) dalla confezione e installarlo al posto del cantilever vecchia. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che il cantilever appena installato AFM non è rotto. Allega °cuticola e del campione di pomodoro (una sezione della cuticola di pomodoro parzialmente deparaffinati ~ 10 mm x 10 mm) su un disco in acciaio inox (campione puck) con nastro biadesivo. Utilizzare un microscopio ottico per verificare che la superficie cuticola rimane piatto e liscio dopo il posizionamento del campione sul disco. Posizionare il disco con il campione pomodoro cuticola sulla regione magnetica nella parte superiore dello scanner SPM. Impostare le prime due viti di regolazione manuale dello scanner ad alta ruotando le manopole, impostare la vite di regolazione motorizzata ritornato più o meno allo stesso livello delle altre due viti frontali. Assicurarsi che tutte e tre le viti siano abbastanza alto per evitare di rompere la punta AFM quando si posiziona il tipholder nella testa SPM. Reinserire il tipholder nella testa SPM e fissarlo stringendo la vite di bloccaggio nella parte posteriore della testa. Dopo aver acceso il laser, allineare il punto laser sul cantilever AFM utilizzando la centrale (y) e destro (x) manopole di regolazione laser sulla parte superiore della testa.Monitorare il fascio laser riflesso su un pezzo di carta per posizionare il punto laser esattamente al termine del cantilever AFM. Regolare la posizione dello specchio mobile iterativamente con le manopole di regolazione fotorivelatore per ottenere massimo segnale (segnale di somma), assicurando così che il fascio laser riflesso viene ricevuto in modo uniforme i quattro quadranti del fotorivelatore. Abbassare la punta AFM ritraendo i manuali viti anteriori di regolazione e la vite di regolazione motorizzata retro dello scanner SPM, monitorare visivamente l'approccio della punta AFM verso la superficie del campione con un microscopio invertito. Assicurarsi che tutte e tre le viti siano allo stesso livello, per evitare artefatti dalle immagini di un campione inclinato. Portare la punta verso il campione, ma non così vicino che i tocchi di punta o interruzioni attraverso la superficie del campione. A questo punto, la luce laser riflessa sul cantilever AFM rimbalzano lo specchio mobile al fotorivelatore. Per il modo AFM contatto con un siliAFM con nitruro di punta, impostare il segnale di OUTPUT (deflessione verticale) Tensione a -2 V per V 0 Setpoint e il segnale DIFF (verticale / orizzontale differenza) a 0 V regolando la posizione dello specchio. Utilizzando il software Nanoscope, fare clic sull'icona microscopio e selezionare il profilo appropriato (Contact modalità AFM). Con la funzione "Controlla le impostazioni di scansione" pannello, impostare la velocità di scansione e le dimensioni ad esempio la scansione, 10 micron formato di scansione e 2 Hz frequenza di scansione. Lasciare la punta AFM per impegnare la superficie del campione, fare clic sul impegnarsi punta icona. Controllando la vite motorizzata posteriore della base SPM, il programma sarà ora abbassare la punta fino ad impegnare la superficie del campione. Il processo di scansione si avvia automaticamente una volta che la punta si è impegnata con successo. Monitorare il processo di scansione utilizzando entrambe le modalità di immagine e campo di applicazione del software, la regolazione dei parametri quali setpoint, guadagno integrale, guadagno proporzionale, dimensioni di scansione, velocità di scansione, linee e campioni per linea iterativo per ottenere il massimorisoluzione delle immagini. Avviare la scansione con un grande asse Z range (scala di dati), poi accuratamente ridurre il valore di scala di dati per osservare il miglior contrasto delle caratteristiche superficiali sull'immagine. Minimizzare il verificarsi di aree bianche nell'immagine scansionata, che indicano che l'altezza delle caratteristiche superficiali supera la disposizione asse z gamma. Cattura l'immagine per salvare il file di dati, quindi elaborare i dati utilizzando le funzioni di spianatura per rimuovere artefatti dovuti alla verticale (Z) deriva scanner, archi di immagine, e verticale tra le linee di scansione; 9 Infine calcolare la rugosità media. Dopo aver salvato i dati, ritirare la punta AFM invertendo l'azione del computer controllato motore della vite che è stato usato per farlo scattare. L'elaborazione delle immagini può essere eseguita in modalità offline analisi delle immagini e / o utilizzando un computer diverso. Utilizzare le manopole frontali in metallo grigio fondo del titolare punta a modificare le posizioni x e y dell'area di scansione, quindi ripetere la misurazione a campione loca cinquezioni per verificare la riproducibilità, sostituendo il cantilever AFM se la qualità dell'immagine si deteriora. 6. Risultati rappresentativi Spostamento Analisi chimica del CPMAS 13 C NMR (Fig. 3) ha identificato i principali gruppi funzionali presenti nella cuticola di pomodoro esaustivo deparaffinati (cutina). Le frazioni di carbonio chiave nella biopolyester cutina sono risultate alifatici a catena lunga (0-45 ppm), alifatici ossigenato (45-110 ppm), si moltiplicano-bonded e aromatici (110-160 ppm) e carbonili (160-220 ppm). Le frazioni alchiliche ossigenati (CHO + CH 2 O) svolgono un ruolo determinante nello stabilire connessioni covalenti tra le unità monomeriche del biopolimero cutina, formando in tal modo l'architettura molecolare della matrice cutina. Le differenze nelle aree dei picchi relativi osservate nella regione spettrale tra 45 e 100 ppm suggeriscono che la cutina mutante ha una percentuale relativamente alta di cross-link di formazione CHO structura frazioni l rispetto al wild-type cutina; attente misurazioni quantitative con polarizzazione diretta (DPMAS) NMR 5 metodi supportano questa inferenza (dati non riportati). CPMAS 13 C NMR ha mostrato un picco cera progressivamente decrescente a 31 ppm (Fig. 4), indicando la rimozione sequenziale di epi-e cere intracuticolare dal cutina-cera composito mantenendo l'architettura principale chimica del biopolimero cutina. Parallela analisi dell'immagine AFM (Fig. 5) ha rivelato irregolarità superficiali dovuti alla estrazione graduale di epi-e cere intracuticolare dalla cuticola frutta, significando alterazioni nell'organizzazione del gruppo cuticolare. . Figura 1 estrattore Soxhlet (fonte immagine: Wikipedia). "/> Figura 2. A) microscopio elettronico a scansione. B) SPM testa (tratto dal manuale di formazione AFM previste dagli strumenti digitali). Figura 3. 150 MHz CPMAS 13 C spettri NMR del esaustivo deparaffinati cuticole pomodoro frutta rossa matura (cutins) da wild-type (M82) e mutanti (CM15) mostrano risonanze con spostamenti chimici corrispondente ai gruppi funzionali di un reticolato acido hydroxyfatty poliestere a base ed anche alcune frazioni moltiplicano incollati. Tutti gli spettri sono stati acquisiti con una frequenza di 10 kHz filatura. Figura 4. 150 MHz 13 CCPMAS spettri NMR delle cuticole commerciali pomodoro frutta rossa matura mostrano cambiamenti di composizione dopo la rimozione sequenziale delle cere epicuticular e intracuticolare mediante estrazione meccanica gomma arabica e un two minuti di cloroformio dip, rispettivamente. Tutti gli spettri sono stati acquisiti con una frequenza di 15 kHz filatura. Figura 5. Immagini AFM e stime rugosità per il pomodoro parzialmente deparaffinati commerciale cuticole descritto in Figura 4, dopo la rimozione graduale di epicuticular (sinistra) e intracuticolare (destra) cere.