3D-samkultur med direkt interaktion: Samkulturande cancerceller med monocyter för att studera deras interaktion

1.3D samkulturer med direkt interaktion

1. Etikett BrC celler och monocyter med olika fluorescerande färgämnen före cellkulturen för att möjliggöra oberoende sortering av varje cell härstamning efter kultur för analys av mRNA och protein uttryck. Använd kommersiellt tillgängliga derivat av kumarin och rhodamin som fritt passerar genom cellmembranet i levande celler. Ett allmänt protokoll för märkning är följande:
   1. Förbered ett monoskikt av BrC-celler av intresse (2 × 10⁶ celler i en 25 cm² odlingskolv) och ersätt standardmediet med tillräcklig förvärmd arbetslösning av det fluorescerande färgämnet (1:2 000 av det fluorescerande färgämnet i standardbasmedium utan tillägg). Inkubera 30 min vid 37 °C i en fuktad 5% CO_2-miljö. Aspirera färglösningen och skölj försiktigt med tillräcklig 1x PBS. Aspirera PBS och lägg till standardmediet.
   2. Trypsinize cellmonoskiktet med 2 ml en lösning på 0,05% trypsin och 0,48 mM EDTA i 5-10 min vid 37 °C. Tillsätt 200 μL FBS för att stoppa trypsinisering och 7 ml av korrespondentmediet utan tillägg. Återanvänd cellerna genom pipetting. Ta en alikvot på 10 μL för att räkna celler i en Neubauerkammare. Fortsätt med samkulturprotokollet efter cellräkning.
   3. Pellet cellerna på 430 x g i 5 min på RT (utför detta först eftersom monocyter växer i suspension). Kassera supernatant och försiktigt återanvänd celler med 3 ml av en förvärmd arbetslösning av fluorescerande färgämne (1:2,000 av fluorescerande färgämnet i ett standardbasmedium utan kosttillskott). Inkubera i 30 min vid 37 °C i en fuktad 5% CO_2-miljö.
   4. Pellet cellerna igen, kassera färgämne arbetslösningen och försiktigt återanvänds med 5-7 ml 1x PBS. Pellet återigen, kassera PBS och återanvänd celler i 5-7 ml standardmedium. Ta en alikvot på 10 μL cellupphängning för att räkna celler i en Neubauerkammare. Fortsätt med samkulturprotokollet efter cellräkning.
2. Ställ in samkulturen på följande sätt: sprid tillräckligt med ECME längst ner i brunnen för att bilda ett jämnt lager i varje brunn i ett 4-brunns kammarreglage. Platta 20 μL av en encellig suspension som innehåller 5 ×^{10 5} märkta BrC-celler per brunn.
3. Efter 15-20 min inkubation vid 37 °C, tillsätt en suspension på 2,5 x 10⁵ märkta monocyter i 80 μL-analysmedium (kompletterat med 60% ECME).
4. Låt ECME stelna i 15-20 min vid 37 °C.
5. Tillsätt 1 ml av en 1:1-blandning av BrC-cellerna och monocytkulturmedierna.
6. Inkubera samkulturer vid 37 °C i en fuktad 5% CO_2-miljö i 24 timmar, 48 timmar eller 5 dagar för att spåra förändringar vid olika tidpunkter.
7. Försämra ECM-proteiner för att återställa cellerna från kulturerna. Aspirera och kassera mediet, tillsätt 0,5 ml 1x PBS med 0,1% trypsin och 0,25% EDTA och inkubera i 3 timmar vid 37 °C. Efter inkubation, tillsätt 0,5 ml 1x PBS med 10% FBS för att neutralisera trypsin och återanvänd cellerna genom att pipetting kraftigt för att få en encellig suspension.
8. Pelletsceller vid 765 x g i 5 min vid RT, kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 5 ml 1x PBS med 10% FBS. Upprepa det här steget en gång.
9. Utsätter cellfjädringen för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) med lämpligt instrument. Se till att de slutliga populationerna är minst 95% rena).
10. Efter sortering, tvätta cellerna med steril 1x PBS, pellet (430 x g i 5 min vid RT) och återanvänd i steril 1x PBS. Celler kan bearbetas enligt specifika protokoll för RNA-isolering eller proteinanalys.
11. Upprepa varje analys tre gånger, inklusive 3D-kulturer för varje enskild cell härstamning som kontroller.