3D-культура с прямым взаимодействием: совместное культивирование раковых клеток с моноцитами для изучения их взаимодействия

1.3D совместно культуры с прямым взаимодействием

1. Этикетка BrC клеток и моноцитов с различными флуоресцентными красителями перед клеточной культурой, чтобы позволить независимой сортировки каждой линии клеток после культуры для анализа мРНК и экспрессии белка. Используйте коммерчески доступные производные кумарина и родамина, которые свободно проходят через клеточную мембрану живых клеток. Общий протокол для маркировки заключается в следующем:
   1. Приготовьте монослой представляющих интерес клеток BRC (2 × 10^{6 клеток в} 25 см 2 культурной колбы)^{и замените стандартную} среду достаточным предварительно разогретым рабочим раствором флуоресцентного красителя (1:2 000 флуоресцентного красителя в стандартной базовой среде без каких-либо добавок). Инкубировать 30 мин при 37 градусов по Цельсию во влажной среде 5% CO_2. Аспирировать раствор красителя и аккуратно промыть достаточным 1x PBS. Аспирировать PBS и добавить стандартную среду.
   2. Трипсинизировать монослой клетки с 2 мл раствора 0,05% трипсина и 0,48 мММ EDTA для 5-10 мин при 37 градусов по Цельсию. Добавьте 200 МКЛ FBS, чтобы остановить трипсинизацию и 7 мл среды-корреспондента без добавок. Resuspend клетки путем pipetting. Возьмите алицит 10 йл, чтобы подсчитать клетки в камере Нойбауэра. Продолжить с протоколом совместной культуры после подсчета клеток.
   3. Пеллет клетки на 430 х г в течение 5 мин на RT (выполнить это первый, так как моноциты растут в подвеске). Откажитесь от супернатантных и мягко повторного использования клеток с 3 мл предварительно разогретого рабочего раствора флуоресцентного красителя (1:2 000 флуоресцентного красителя в стандартной базовой среде без добавок). Инкубационный в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию в увлажненной среде 5% CO_2.
   4. Пеллет клетки снова, отказаться от красителя рабочий раствор, и осторожно повторно с 5-7 мл 1x PBS. Пеллет еще раз, отбросить PBS, и повторного перерасхода клеток в 5-7 мл стандартной среды. Возьмите алицит 10 МКЛ клеточной подвески, чтобы подсчитать клетки в камере Нойбауэра. Продолжить с протоколом совместной культуры после подсчета клеток.
2. Установите со-культуры следующим образом: распространение достаточно ECME в нижней части хорошо, чтобы сформировать овый слой в каждом хорошо 4-хорошо камеры слайд системы. Плита 20 МКЛ одной клеточной подвески, содержащей 5 × 10⁵ помеченных клеток BRC на колодец.
3. После 15-20 мин инкубации при 37 градусов по Цельсию добавьте суспензию 2,5 х^{10 5} помеченных моноцитов в 80 мкл анализа среды (дополнено 60% ECME).
4. Разрешить ECME затвердеть в течение 15-20 минут при 37 градусов по Цельсию.
5. Добавьте 1 мл смеси клеток BrC и моноцитов культуры 1:1.
6. Инкубация со-культур при 37 градусах Цельсия в увлажненной среде 5% CO_{2 в} течение 24 ч, 48 ч или 5 дней для отслеживания изменений в разных точках времени.
7. Деградация белков ECM для восстановления клеток из культур. Аспират и отбросить средний, добавить 0,5 мл 1x PBS с 0,1% трипсина и 0,25% ЭДТА, и инкубировать в течение 3 ч при 37 градусов по Цельсию. После инкубации добавьте 0,5 мл 1x PBS с 10% FBS, чтобы нейтрализовать трипсин, и повторно потекут клетки, энергично трубя, чтобы получить одноклеточную подвеску.
8. Пеллетные клетки на 765 х г в течение 5 мин на RT, отказаться от супернатанта, и повторного перерасхода клеток в 5 мл 1x PBS с 10% FBS. Повторите этот шаг один раз.
9. Подавсть клетки к флуоресценции активированной сортировке клеток (FACS) с соответствующим инструментом. Убедитесь, что конечные популяции, по крайней мере 95% чистой).
10. После сортировки, мыть клетки с стерильными 1x PBS, гранулы (430 х г в течение 5 мин на RT), и повторно в стерильных 1x PBS. Клетки могут быть обработаны в соответствии с конкретными протоколами для изоляции РНК или анализа белка.
11. Повторите каждый анализ три раза, в том числе 3D культур каждой отдельной линии клеток в качестве элементов управления.