3D-samkultur med direkte interaksjon: Kokulturerende kreftceller med monocytter for å studere samspillet

1.3D samkulturer med direkte interaksjon

1. Merk BrC-celler og monocytter med forskjellige fluorescerende fargestoffer før cellekulturen for å tillate uavhengig sortering av hver cellelinje etter kultur for analyse av mRNA og proteinuttrykk. Bruk kommersielt tilgjengelige derivater av kumarin og rhodamin som fritt passerer gjennom cellemembranen til levende celler. En generell protokoll for merking er følgende:
   1. Forbered en monolayer av BrC-celler av interesse (2 × 10⁶ celler i en 25 cm² kulturflaske) og erstatt standardmediet med tilstrekkelig forvarmet arbeidsløsning av fluorescerende fargestoff (1:2,000 av fluorescerende fargestoff i standard basismedium uten supplement). Inkuber 30 min ved 37 °C i et fuktet 5 % CO_2-miljø. Aspirer fargestoffoppløsningen og skyll forsiktig med tilstrekkelig 1x PBS. Aspirer PBS og legg til standardmediet.
   2. Prøv cellemonolayeren med 2 ml av en løsning på 0,05% trypsin og 0,48 mM EDTA i 5-10 min ved 37 °C. Tilsett 200 μL FBS for å stoppe trypsinisering og 7 ml av korrespondentmediet uten kosttilskudd. Resuspend cellene ved pipettering. Ta en aliquot på 10 μL for å telle celler i et Neubauer-kammer. Fortsett med samkulturprotokollen etter celletelling.
   3. Pellet cellene på 430 x g i 5 min ved RT (utfør dette først siden monocytter vokser i suspensjon). Kast supernatante og forsiktig resuspend celler med 3 ml av en forvarmet arbeidsløsning av fluorescerende fargestoff (1:2,000 av fluorescerende fargestoff i et standard basemedium uten kosttilskudd). Inkuber i 30 min ved 37 °C i et fuktet 5 % CO_2-miljø.
   4. Pellet cellene igjen, kast fargestoffets arbeidsløsning, og forsiktig resuspend med 5-7 ml 1x PBS. Pellet igjen, kast PBS og resuspend celler i 5-7 ml standard medium. Ta en aliquot på 10 μL celleoppheng for å telle celler i et Neubauer-kammer. Fortsett med samkulturprotokollen etter celletelling.
2. Sett samkulturen som følger: Spred nok ECME på bunnen av brønnen til å danne et jevnt lag i hver brønn i et 4-brønns kammerskliesystem. Plate 20 μL av en enkeltcellet suspensjon som inneholder 5 × 10⁵ merkede BrC-celler per brønn.
3. Etter 15-20 min inkubasjon ved 37 °C, tilsett en suspensjon på 2,5 x 10⁵ merkede monocytter i 80 μL analysemedium (supplert med 60 % ECME).
4. La ECME størkne i 15-20 min ved 37 °C.
5. Tilsett 1 ml av en 1:1-blanding av BrC-cellene og monocyttkulturmediene.
6. Inkubere samkulturer ved 37 °C i et fuktet 5 % CO_2-miljø i 24 timer, 48 timer eller 5 dager for å spore endringer på forskjellige tidspunkter.
7. Degrader ECM-proteiner for å gjenopprette cellene fra kulturene. Aspirer og kast mediet, tilsett 0,5 ml 1x PBS med 0,1% trypsin og 0,25% EDTA, og inkuber i 3 timer ved 37 °C. Etter inkubasjon, tilsett 0,5 ml 1x PBS med 10% FBS for å nøytralisere trypsin, og resuspend cellene ved pipettering kraftig for å oppnå en encellet suspensjon.
8. Pelletsceller på 765 x g i 5 minutter ved RT, kast supernatanten og resuspend cellene i 5 ml 1x PBS med 10% FBS. Gjenta dette trinnet én gang.
9. Underkast cellefjæringen til fluorescensaktivert cellesortering (FACS) med riktig instrument. Sørg for at de endelige populasjonene er minst 95% rene).
10. Etter sortering, vask cellene med steril 1x PBS, pellets (430 x g i 5 min ved RT), og resuspend i steril 1x PBS. Celler kan behandles i henhold til spesifikke protokoller for RNA-isolasjon eller proteinanalyse.
11. Gjenta hver analyse tre ganger, inkludert 3D-kulturer for hver enkelt cellelinje som kontroller.