3D שיתוף תרבות עם אינטראקציה ישירה: שיתוף culturing תאים סרטניים עם מונוציטים ללמוד את האינטראקציה שלהם

1.3D תרבויות משותפות עם אינטראקציה ישירה

1. תווית תאי BrC ומונוציטים עם צבעים פלואורסצנטיים שונים לפני תרבות התא כדי לאפשר מיון עצמאי של כל שושלת תאים לאחר תרבות לניתוח של mRNA וביטוי חלבון. השתמש נגזרות זמינות מסחרית של קומרין ורודמין כי בחופשיות לעבור דרך קרום התא של תאים חיים. פרוטוקול כללי לתיוג הוא הפרוטוקול הבא:
   1. הכינו מונולאייר של תאי BrC מעניינים (2 × 10⁶ תאים בבקבוק תרבות בגודל 25 ס"מ²⁾ והחלפו את המדיום הסטנדרטי בתמיסת עבודה מספיק מחוממת מראש של צבע הפלואורסצנטי (1:2,000 צבע פלואורסצנטי במדיום בסיס סטנדרטי ללא כל תוספת). דגירה 30 דקות ב 37 °C (69 °F) בסביבה לחה 5% CO_2. לשאוף את תמיסת הצבע ולשטוף בעדינות עם PBS 1x מספיק. שאפו את ה-PBS והוסיפו את המדיום הסטנדרטי.
   2. טריפסיניזציה מונולייר התא עם 2 מ"ל של פתרון של 0.05% טריפסין ו 0.48 mM EDTA עבור 5-10 דקות ב 37 °C (69 °F). הוסף 200 μL של FBS כדי לעצור טריפסיניזציה ו 7 מ"ל של מדיום הכתב ללא תוספי מזון. התחדשו בתאים על ידי צנרת. קח aliquot של 10 μL לספור תאים בתא Neubauer. המשך בפרוטוקול התרבות המשותפת לאחר ספירת תאים.
   3. גלולה התאים ב 430 x g במשך 5 דקות ב RT (לבצע את זה הראשון מאז מונוציטים לגדול בהשעיה). השלך תאים על-טבעיים והתחדש בעדינות עם 3 מ"ל של פתרון עבודה מחומם מראש של צבע הפלואורסצנטי (1:2,000 צבע פלואורסצנטי במדיום בסיס סטנדרטי ללא תוספי מזון). דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחות 5% CO_2.
   4. גלול את התאים שוב, להשליך את פתרון העבודה צבע, בעדינות resuspend עם 5-7 מ"ל של 1x PBS. גלולה פעם נוספת, להשליך את PBS, ו resuspend תאים 5-7 מ"ל של מדיום סטנדרטי. קח aliquot של 10 μL של השעיית תא לספור תאים בתא Neubauer. המשך בפרוטוקול התרבות המשותפת לאחר ספירת תאים.
2. הגדר את התרבות המשותפת כדלקמן: הפץ מספיק ECME בתחתית הבאר כדי ליצור שכבה זוגית בכל באר של מערכת שקופיות קאמרית של 4 בארות. צלחת 20 μL של השעיית תא יחיד המכיל 5 × 10⁵ תאים BrC שכותרתו היטב.
3. לאחר 15-20 דקות של דגירה ב 37 °C (67 °F), להוסיף השעיה של 2.5 x 10⁵ מונוציטים שכותרתו ב 80 μL assay בינוני (בתוספת 60% ECME).
4. אפשר ל-ECME להתמצק למשך 15-20 דקות ב-37°C.
5. הוסף 1 מ"ל של תערובת של 1:1 של תאי BrC ומדיית תרבות מונוציט.
6. דגירה co-תרבויות ב 37 °C (69 °F) בסביבה לחות 5% CO₂ עבור 24 שעות, 48 שעות, או 5 ימים כדי לעקוב אחר שינויים בנקודות זמן שונות.
7. להשפיל חלבוני ECM כדי לשחזר את התאים מן התרבויות. לשאוף ולהשליך את המדיום, להוסיף 0.5 מ"ל של 1x PBS עם 0.1% טריפסין ו 0.25% EDTA, ואת הדגירה עבור 3 שעות ב 37 °C (69 °F). לאחר הדגירה, להוסיף 0.5 מ"ל של 1x PBS עם 10% FBS כדי לנטרל את טריפסין, ולהניח מחדש את התאים על ידי pipetting במרץ כדי להשיג השעיה של תא יחיד.
8. כדורי תאים ב 765 x g במשך 5 דקות ב RT, להשליך את supernatant, ו resuspend התאים ב 5 מ"ל של 1x PBS עם 10% FBS. חזור על שלב זה פעם אחת.
9. הכפיף את השעיית התא למיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות הכלי המתאים. ודא כי האוכלוסיות הסופיות הן לפחות 95% טהור).
10. לאחר המיון, לשטוף את התאים עם סטרילי 1x PBS, גלולה (430 x g במשך 5 דקות ב RT), ו resuspend ב סטרילי 1x PBS. תאים יכולים להיות מעובדים על פי פרוטוקולים ספציפיים לבידוד RNA או ניתוח חלבון.
11. חזור על כל הזמנה שלוש פעמים, כולל תרביות תלת-ממדיות של כל שושלת תאים בנפרד כפקדים.