Co-cultura 3D com interação direta: co-cultivar células cancerígenas com monócitos para estudar sua interação

1.3D co-culturas com interação direta

1. Rotular células BrC e monócitos com diferentes corantes fluorescentes antes da cultura celular para permitir a classificação independente de cada linhagem celular após cultura para análise de mRNA e expressão proteica. Use derivados comercialmente disponíveis de coumarina e rhodamina que passam livremente pela membrana celular das células vivas. Um protocolo geral para rotulagem é o seguinte:
   1. Prepare uma monocamada de células brc de interesse (2 × 10⁶ células em um frasco de cultura^{de 25 cm 2)} e substitua o meio padrão por solução de trabalho pré-aquecida suficiente do corante fluorescente (1:2.000 do corante fluorescente no meio base padrão sem qualquer suplemento). Incubar 30 min a 37 °C em um ambiente umidificado de 5% de CO_2. Aspire a solução de corante e enxágue suavemente com 1x de PBS suficiente. Aspire o PBS e adicione o meio padrão.
   2. Trypsinize a monocamada celular com 2 mL de uma solução de 0,05% de trippsina e 0,48 mM EDTA para 5-10 min a 37 °C. Adicione 200 μL de FBS para parar a trippsinização e 7 mL do meio correspondente sem suplementos. Resuspense as células por pipetação. Tome uma alíquota de 10 μL para contar células em uma câmara de Neubauer. Continue com o protocolo de co-cultura após a contagem de células.
   3. Pelota as células a 430 x g por 5 min em RT (realize esta primeira vez que os monócitos crescem em suspensão). Descarte células supernascidas e suavemente resuspendas com 3 mL de uma solução de trabalho pré-aquecida do corante fluorescente (1:2.000 do corante fluorescente em um meio de base padrão sem suplementos). Incubar por 30 min a 37 °C em um ambiente umidificado de 5% de CO_2.
   4. Pelotar as células novamente, descartar a solução de trabalho de corante e reaprpor suavemente com 5-7 mL de 1x PBS. Pelota mais uma vez, descarte o PBS e resuspend as células em 5-7 mL de meio padrão. Tome uma alíquota de 10 μL de suspensão celular para contar células em uma câmara de Neubauer. Continue com o protocolo de co-cultura após a contagem de células.
2. Defina a co-cultura da seguinte forma: espalhe eCME suficiente na parte inferior do poço para formar uma camada uniforme em cada poço de um sistema de slides de câmara de 4 poços. Placa 20 μL de uma única suspensão celular contendo 5 × 10⁵ células BrC rotuladas por poço.
3. Após 15-20 min de incubação a 37 °C, adicione uma suspensão de 2,5 x 10⁵ monócitos rotulados em 80 μL médio de ensaio (suplementado com 60% de ECME).
4. Deixe o ECME solidificar por 15-20 min a 37 °C.
5. Adicione 1 mL de uma mistura de 1:1 das células BrC e mídia de cultura monocito.
6. Incubar co-culturas a 37 °C em um ambiente umidificado de 5% de CO₂ por 24h, 48 h ou 5 dias para acompanhar as mudanças em diferentes pontos de tempo.
7. Degradar proteínas ECM para recuperar as células das culturas. Aspire e descarte o médio, adicione 0,5 mL de 1x PBS com trippsina de 0,1% e 0,25% EDTA, e incubar por 3h a 37 °C. Após a incubação, adicione 0,5 mL de 1x PBS com 10% de FBS para neutralizar a trippsina, e resuspenque as células por pipetação vigorosamente para obter uma suspensão unicelular.
8. Células de pelotas a 765 x g por 5 min em RT, descartam o supernasciente e resuspensam as células em 5 mL de 1x PBS com 10% de FBS. Repita este passo uma vez.
9. Sujeitar a suspensão celular à triagem celular ativada por fluorescência (FACS) com o instrumento apropriado. Certifique-se de que as populações finais são pelo menos 95% puras).
10. Após a triagem, lave as células com PBS 1x estéril, pelota (430 x g por 5 min em RT) e resuspenque em 1x PBS estéril. As células podem ser processadas de acordo com protocolos específicos para isolamento de RNA ou análise de proteínas.
11. Repita cada ensaio três vezes, incluindo culturas 3D de cada linhagem celular individual como controles.